Ассоциация полиморфизма генов некоторых провоспалительных цитокинов с риском развития преэклампсии

Л.М. ШАРАФЕТДИНОВА¹, А.М. МАЗИТОВА¹, О.А. КРАВЦОВА¹, Л.И. МАЛЬЦЕВА², Е.Ю. ЮПАТОВ²

¹Казанский (Приволжский) федеральный университет, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18

²Казанская государственная медицинская академия, 420043, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 36

Шарафетдинова Лилия Масхутовна — аспирант кафедры биохимии и биотехнологии, тел. (843) 233-78-31, e-mail: [email protected]

Мазитова Александра Маратовна — студентка кафедры биохимии и биотехнологии, тел. (843) 233-78-31, e-mail: [email protected]

Кравцова Ольга Александровна — кандидат биологических наук, доцент, кафедры биохимии и биотехнологии, тел. (843) 233-78-31, e-mail: [email protected]

Мальцева Лариса Ивановна — доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой акушерства и гинекологии № 1, тел. +7-905-314-40-51, e-mail: [email protected]

Юпатов Евгений Юрьевич — кандидат медицинских наук, доцент кафедры акушерства и гинекологии № 1, тел. +7-917-873-87-21, e-mail: [email protected]

В статье представлены результаты оценки влияния полиморфизма генов провоспалительных цитокинов — ИЛ1β (rs1143634), ИЛ6 (rs1800795) и ФНО-α (rs1800629)) на формирование наследственной предрасположенности к развитию преэклампсии у женщин Республики Татарстан. Исследование проведено у 210 пациенток, 140 из которых имели физиологически протекающую беременность, а 70 — признаки преэклампсии. При оценке уровня провоспалительных цитокинов ИЛ1β, ИЛ6 и ФНО-α в исследуемых группах статистически значимых различий не обнаружено, кроме того, данные показатели находились в пределах нормальных значений. При анализе вклада в генетическую предрасположенность к преэклампсии полиморфизма генов, кодирующих исследованные цитокины, установлено, что носительницы гетерозиготного генотипа по полиморфному локусу гена ФНО-α имеют повышенный риск развития осложнения беременности (ОШ=1,9118; 95%ДИ 1,2446-2,9366), тогда как по остальным исследованным локусам статистически значимых различий также не обнаружено.

Ключевые слова: преэклампсия, провоспалительные цитокины, полиморфизм генов.

 

L.M. SHARAPHETDINOVА¹, A.M. MAZITOVA¹, O.A. KRAVTSOVA¹, L.I. MALTSEVA², E.Yu. YUPATOV²

¹Kazan (Volga region) Federal University, 18 Kremlevskaya St., Kazan, Russian Federation, 420008

²Kazan State Medical Academy, 36 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420043

Association of polymorphism of genes of several proinflammatory cytokines and the risk of pre-eclampsia

Sharaphetdinova L.M. — postgraduate student of the Department of Biochemistry and Biotechnology, tel. (843) 233-78-31, e-mail: [email protected]

Mazitova A.M. — student of the Department of Biochemistry and Biotechnology, tel. (843) 233-78-31, e-mail: [email protected]

Kravtsova O.A. — Cand. Biol. Sc., Associate Professor of the Department of Biochemistry and Biotechnology, tel. (843) 233-78-31, e-mail: [email protected]

Maltseva L.I. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Obstetrics and Gynecology № 1, tel. +7-905-314-40-51, e-mail: [email protected]

Yupatov E.Yu. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Obstetrics and Gynecology № 1, tel. +7-917-873-87-21, e-mail: [email protected]

The article presents the results of the assessment of the impact of inflammatory cytokine gene polymorphisms IL1β (rs1143634), IL6 (rs1800795) and TNF-α (rs1800629) on the formation of hereditary predisposition to the development of pre-eclampsia in women of the Republic of Tatarstan. There were studied 210 patients, of which 140 were with uncomplicated pregnancy, and 70 had signs of pre-eclampsia. When assessing the level of proinflammatory cytokines IL1β, IL and TNF-α the groups studied had no statistically significant differences, in addition, these indicators had normal values. When analyzing the contribution of polymorphism of genes, encoding investigated cytokines, to genetic predisposition to preeclampsia, it was found that women with heterozygous genotype at a polymorphic locus of the gene TNF-α have an increased risk of pregnancy complications (OR=1,9118; 95%CI at 1.2446-2,9366), while the rest of the investigated loci had no statistically significant differences.

Key words: preeclampsia, proinflammatory cytokines, polymorphism of genes.

 

В ряде случаев течение беременности может осложняться различными патологическими состояниями. В настоящее время одним из распространенных осложнений беременности является преэклампсия (5-7% всех беременностей), которая занимает одну из лидирующих позиций в структуре перинатальной заболеваемости и смертности [1]. Эпидемиологические и семейные исследования показывают, что преэклампсия является мультифакторным заболеванием, на развитие которого оказывают влияние такие параметры, как этническая принадлежность, статус плаценты, особенности питания и другие факторы. Предложено несколько механизмов развития преэклампсии, описывающих сложный характер влияния факторов окружающей среды на фоне наследственной предрасположенности, однако до сих пор не выявлены первичные причины ее развития [2]. Известно, по крайней мере, около 100 генов-кандидатов, формирующих генетический риск возникновения преэклампсии, одними из которых являются и гены про- и противовоспалительных цитокинов [3].

В связи с этим целью исследования явился анализ ассоциации полиморфизма генов провоспалительных интерлейкинов — ИЛ1β (+3953 C/T, rs1143634), ИЛ6 (-174C/G, rs1800795) и ФНО-α (-308 G/A, rs1800629) с риском развития преэклампсии в группе женщин, представляющих население Республики Татарстан.

Материалы и методы

Выборка беременных составила 210 женщин г. Казани, средний возраст исследуемых составил 27±5 лет. Контрольную группу составили 140 женщин с физиологическим течением беременности, 70 женщин — с установленной преэклампсией на основании «триады» признаков: повышение артериального давления (АД), протеинурии и наличие отеков. Дополнительными параметрами служило выявление нарушений кровотока при допплерометрии, синдрома задержки развития плода (СЗРП), признаков гипоксии плода по данным КТГ.

В исследуемых группах первая беременность наблюдалась у 47,62%, повторная — у 52,38%, при этом группу первородящих составили 72% женщин, повторнородящих — 28%. Несмотря на нормально протекающую беременность и роды, 5% женщин контрольной группы страдали заболеваниями почек, но показатели АД находились в пределах нормы и составили, в среднем, 110/68 мм рт.ст. В группе исследуемых с преэклампсией частота заболеваний почек составила 25,7%, ожирением страдали 21,43% женщин. Уровень АД был повышен и составил в среднем 131/88 мм рт.ст.

У всех включенных в исследование женщин проводили определение уровня ИЛ1β, ИЛ6 и ФНО-α в плазме крови методом ИФА согласно инструкции фирмы-производителя (НПО «ВекторБест», г. Новосибирск). Материалом для генотипирования послужили образцы ДНК, полученные из лейкоцитов венозной крови, выделение которых проводилось с использованием коммерческого набора реактивов «ДНК-экспресс» фирмы «НПФ Литех» (г. Москва).

Анализ полиморфизмов генов осуществляли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием праймеров и зондов производства ООО «СибДНК» (г. Новосибирск) на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью программы UNPHASED версии 3.1.5 (программа находится в режиме свободного доступа (http://homepages.lshtm.ac.uk/frankdudbridge/software/unphased/).

Различия между группами по частотам встречаемости аллелей и генотипов исследованных полиморфных локусов оценивали по критерию χ² при уровне значимости р<0,05, оценку ассоциаций полиморфизмов генов — на основе расчета отношения шансов (ОШ) и 95% доверительного интервала (ДИ).

Результаты исследования

Средний уровень провоспалительных цитокинов значимо не отличался между исследованными группами женщин с нормально протекающей беременностью и беременностью, отягощенной преэклампсией, и находился в пределах нормальных значений (табл. 1).

Таблица 1.

Средний уровень провоспалительных цитокинов в исследуемых группах

Уровень цитокина, пг/мл	Неосложненная беременность (n=140)	Беременность, отягощенная преэклампсией (n=70)
ИЛ1β	3,62±1,74	4,42±2,33
ИЛ6	5,88±3,11	7,78±3,46
ФНО-α	6,2±2,25	6,5±1,36

 

При анализе распределения частот аллелей и генотипов исследованных локусов показано статистически значимое увеличение доли гетерозиготных генотипов полиморфных локусов генов ИЛ6 и ФНО-α в группе женщин, отягощенных преэклампсией (p<0,05), тогда как по полиморфизму гена ИЛ1β статистически значимых различий не обнаружено (табл. 2). 

Таблица 2.

Распределение частот генотипов исследуемых маркеров

Генотип	Неосложненная беременность (n=140)		Беременность, отягощенная преэклампсией (n=70)	Значение р*
Полиморфизм +3953 С/Т гена ИЛ1β
CCCTTT	0,37860,58570,0357		0,24290,71420,0429	0,1446
Полиморфизм -174 C/G гена ИЛ6
CCCGGG	0,350,37860,2714		0,30,55710,1429	0,0284
Полиморфизм -308 G/A гена ФНО-α
GGGAAA	0,57860,31430,1071		0,32860,52860,1428	0,0025

Примечание: * — различия между группами с физиологически нормально протекающей беременностью и осложненной преэклампсией

 

Расчеты показателей отношения шансов выявили достоверную ассоциацию с риском развития преэклампсии только для полиморфизма гена ФНО-α (ОШ=1,9118; 95%ДИ 1,2446-2,9366), тогда как для полиморфизма гена ИЛ6, несмотря на показатель ОШ>1, достоверных значений не получено (ОШ=1,1729; 95% ДИ 0,7787-1,7666).

Обсуждение результатов

Преэклампсия является грозным осложнением физиологически протекающей беременности, характеризуется гипертензией и протеинурией после 20-й недели гестации. Показано, что основная роль в развитии преэклампсии принадлежит ишемии плаценты, которая возникает в результате дисбаланса анти- и ангиогенных факторов и эндотелиальной дисфункции [3]. Ведущую роль в реализации механизмов ишемии принадлежит, по результатам исследования Маттера с коллегами, циркулирующей растворимой форме fms-подобной форме тирозинкиназы-1 (sFlt-1, известной также как VEGFR1), которая связывает не только эндотелиальный (VEGF), но и плацентарный фактор роста (PIGF). Кроме того, показано, что существует и другой анти-ангиогенный протеин, так называемый эндоглин, который действует в синергизме с sFlt-1 и также может являться одним из потенциальных белков, участвующих в патогенезе преэклампсии [1, 2, 4].

Однако в исследовании, проведенном в 2009 г. было показано, что предпосылки к развитию преэклампсии могут быть выявлены еще в первом триместре на основании дифференциальной экспрессии генов, основную часть из которых составляют гены, белковые продукты которых участвуют в регуляции функций иммунной системы. Авторами сделано предположение, что преэклампсия обусловлена дисрегуляцией иммунной системы мать-плод, анормальной децидуализацией и, как следствие, нарушением инвазии трофобласта [5]. В ряде исследований у пациенток с преэклампсией обнаружена иммунодисрегуляция, которая обусловлена выраженным сдвигом иммунной реакции с Th1-ответа в сторону Th2-пути. В то же время выявлено, что не только Т-хелперы и Т-супрессоры являются основными звеньями регуляции процессов эмбриогенеза, но существует и дополнительный путь регуляции, т.н. Th17, который координируется регуляторными Т-клетками. При этом уровень выработки провоспалительных цитокинов напрямую зависит от уровня трансформирующего фактора роста и ИЛ10 или же регулируется прямым межклеточным взаимодействием [6].

Исследованиями многих авторов установлено, что физиологически протекающая беременность всегда сопровождается воспалительными процессами, при усилении которых возникают предпосылки для развития преэклампсии. При этом основными медиаторами взаимодействия клеток иммунной системы организма матери и плода являются интерлейкины, играющие важную роль в имплантации, росте и развитии эмбриона.

Рядом авторов показано, что цитокины, такие как ФНО-α, интерферон-гамма и некоторые другие, индуцируют апоптоз трофобласта, ограничивают дифференциацию и вторжение трофобласта в спиральные артерии, при этом преобладание провоспалительных цитокинов (TNFa и IL-17a) на фоне высокого уровня противовоспалительных (IL-10 и IL-4) свидетельствует о нарушении процесса физиологической перестройки иммунной системы в иммуносупрессорном направлении ко второму триместру беременности у беременных с синдромом потери плода в анамнезе [7]. При этом в плаценте у женщин с преэклампсией выявлено достоверное увеличение уровня экспрессии генов IL1β, IL10 TNF-α, что может быть ассоциировано с плацентарной недостаточностью и эндотелиальной дисфункцией, хотя прямой корреляции между этими параметрами в данном исследовании обнаружено не было [8].

Однако в данном исследовании увеличения уровня провоспалительных цитокинов не выявлено как в контрольной группе, так и у женщин с диагнозом «преэклампсия» (табл. 1). Возможно, это связано либо с малочисленностью исследованных групп, либо с «недоразвитием» клинических симптомов данной патологии.

В то же время исследования семейных случаев показывают, что предрасположенность к преэклампсии имеет определенную наследственную компоненту. В настоящее время известно, что преэклампсия имеет мультифакторную природу, причем риск развития данного осложнения в 5 и более раз выше при наличии положительного семейного анамнеза. Генетическая природа развития преэклампсии обусловлена взаимодействием более чем сотни генов, полиморфизм каждого из которых может оказывать существенный вклад в наследственную компоненту данного осложнения беременности. Так, при анализе генетического вклада более 700 однонуклеотидных полиморфных локусов в 190 генах в развитие преэклампсии установлена ассоциация с генами COL1A, IL1A, PLAUR, MTHFR, IGF1 IL4R и NOS3 [9].

В то же время, учитывая влияние дисбаланса цитокинов на регуляцию имплантации, роста и развития эмбриона, участие генов, кодирующих выработку определенных цитокинов, могут рассматриваться в качестве генов-кандидатов в формировании предрасположенности к преэклампсии. В данной работе исследована ассоциация полиморфизма генов трех основных провоспалительных цитокинов — ИЛ1β, ИЛ6 и ФНО-α, причем полиморфизм ИЛ1β обусловлен структурной перестройкой (миссенс-мутация для гена ИЛ1β), тогда как полиморфизм генов ИЛ6 и ФНО-α локализован в промоторной области, что напрямую может быть связано с уровнем экспрессии гена и, следовательно, с уровнем выработки соответствующего цитокина.

Согласно данным, полученным de Lima с соавт., полиморфизм генов ФНО-α и ИЛ6 наряду с генами IFN-γ, IL10, TGF-β1 ассоциирован с риском развития преэклампсии у женщин из Бразилии [10]. В нашем исследовании установлено, что гетерозиготные носительницы по полиморфизма гена ФНО-α имеют почти в 2 раза повышенный риск развития преэклампсии, та же тенденция наблюдается и для гетерозигот по полиморфизму гена ИЛ6, хотя достоверных отличий обнаружено не было. Аналогичные данные получены и для женщин из РФ: у беременных женщин с синдромом потери плода наблюдаются нарушения баланса про-и противовоспалительных цитокинов за счет повышения уровня IL-10, IL-6, IL-17а, TNFa. При этом чаще встречаются гетерозиготы по полиморфным маркерам генов IL-10 (мутация 1, G-1082A), IL-4 (С-589-Т), TNFa (G-308A), IL-17f His 161Аrg (7488A/G) [7].

Таким образом, проведенные исследования достоверно указывают на роль гетерозиготного носительства по полиморфизму -308GA гена ФНО-α как маркера генетической предрасположенности к преэклампсии, однако данные исследования носят предварительный характере и должны быть продолжены с включением большего числа обследованных и расширением числа генетических маркеров.

 

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Mutter W.P., Karumanchi S.A. Molecular mechanisms of preeclampsia // Microvascular Research. — 2008. — Vol. 75. — P. 1-8.
2. Sibai B., Dekker G., Kupferminc M. Pre-eclampsia // The Lancet. — 2005. — 365, № 9461. — P. 785-799.
3. Lyle G. Best, Melanie Nadeau, Kylie Davis, Felicia Lamb, Shellee Bercier, Cindy M. Anderson. Genetic variants, immune function and risk of preeclampsia among American Indians // Am J Reprod Immunol. — 2012 February. — Vol. 67 (2). — Р. 152-159. doi:10.1111/j.1600-0897.2011.01076.x.
4. Young B.C., Levine R.J., Karumanchi S.A. Pathogenesis of preeclampsia // Annu Rev Pathol. — 2010. — Vol. 5. — P. 173-192.
5. Founds S.A., Conley Y.P., Lyons-Weiler J.F., Jeyabalan A., Hogge W.A., Conrad K.P. Altered global gene expression in first trimester placentas of women destined to develop preeclampsia // Placenta. 2009 Jan. — Vol. 30 (1). — Р. 15-24.
6. Saito S., Nakashima A., Shima T., Ito M. Th1/Th2/Th17 and Regulatory T-cell Paradigm in Pregnancy // Am J Reprod Immunol. — 2010. — Vol. 63. — P. 601-610. doi: 10.1111/j.1600-0897.2010.00852.x. Epub 2010 Apr 23.
7. Питиримова Л.Н. Особенности аллельного полиморфизма генов интерлейкинов и цитокиновый баланс женщин с невынашиванием беременности // Акушерство и гинекология. — 2014. — № 3. — С. 33-38.
8. Rinehart B.K., Terrone D.A., Lagoo-Deenadayalan S., Barber W.H., Hale E.A., Martin J.N.Jr., Bennett W.A. Expression of the placental cytokines tumor necrosis factor alpha, interleukin 1 beta, and interleukin 10 is increased in preeclampsia // Am J Obstet Gynecol. — 1999. — Vol. 181. — Р. 915-920.
9. Goddard K.A., Tromp G., Romero R. et al. Candidate-gene association study of mothers with pre-eclampsia, and their infants, analyzing 775 SNPs in 190 genes // Hum Hered. — 2007. — Vol. 63 (1). — Р. 1-16.
10. Pendeloski K.P., Sass N., Torloni M.R., Mattar R., Moron A.F., Franchim C.S. et al. Immunoregulatory gene polymorphisms in women with preeclampsia // Hypertens Res. — 2010 Dec 16.

 

 

REFERENCES

1. Mutter W.P., Karumanchi S.A. Molecular mechanisms of preeclampsia. Microvascular Research., 2008, vol. 75, pp. 1-8.
2. Sibai B., Dekker G., Kupferminc M. Pre-eclampsia. The Lancet, 2005, 365, no. 9461, pp. 785-799.
3. Lyle G. Best, Melanie Nadeau, Kylie Davis, Felicia Lamb, Shellee Bercier, Cindy M. Anderson. Genetic variants, immune function and risk of preeclampsia among American Indians. Am J Reprod Immunol., 2012, February, vol. 67 (2), rr. 152-159. doi:10.1111/j.1600-0897.2011.01076.x.
4. Young B.C., Levine R.J., Karumanchi S.A. Pathogenesis of preeclampsia. Annu Rev Pathol., 2010, vol. 5, pp. 173-192.
5. Founds S.A., Conley Y.P., Lyons-Weiler J.F., Jeyabalan A., Hogge W.A., Conrad K.P. Altered global gene expression in first trimester placentas of women destined to develop preeclampsia. Placenta, 2009, Jan., vol. 30 (1), rr. 15-24.
6. Saito S., Nakashima A., Shima T., Ito M. Th1/Th2/Th17 and Regulatory T-cell Paradigm in Pregnancy. Am J Reprod Immunol., 2010, vol. 63, pp. 601-610. doi: 10.1111/j.1600-0897.2010.00852.x. Epub 2010 Apr 23.
7. Pitirimova L.N. Features of allelic polymorphism of genes and cytokine interleukin balance of women with miscarriage. Akusherstvo i ginekologiya, 2014, no. 3, pp. 33-38 (in Russ.).
8. Rinehart B.K., Terrone D.A., Lagoo-Deenadayalan S., Barber W.H., Hale E.A., Martin J.N.Jr., Bennett W.A. Expression of the placental cytokines tumor necrosis factor alpha, interleukin 1 beta, and interleukin 10 is increased in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol., 1999, vol. 181, rr. 915-920.
9. Goddard K.A., Tromp G., Romero R. et al. Candidate-gene association study of mothers with pre-eclampsia, and their infants, analyzing 775 SNPs in 190 genes. Hum Hered., 2007, vol. 63 (1), rr. 1-16.
10. Pendeloski K.P., Sass N., Torloni M.R., Mattar R., Moron A.F., Franchim C.S. et al. Immunoregulatory gene polymorphisms in women with preeclampsia. Hypertens Res., 2010, Dec 16.