Фунгицидная активность хитозана в отношении мицелиальных грибов


Противогрибные свойства хитозана в настоящее время интенсивно исследуются. В работе исследовано ингибирующее влияние низкомолекулярного хитозана на некоторые виды мицелиальных грибов.Antifungal activity of chitosan against mycelial fungi

Chitosan is extensively used as an antifungal compound. Low molecular weight chitosan showed antifungal activity against mycelial fungi.

Грибы способны вызывать заболевания, известные как микозы. Среди них особую группу составляют патогенные плесневые грибы, вызывающих разнообразные поражения. Обычно они вызывают поражения у лиц с серьезными нарушениями иммунитета. В настоящее время многочисленными исследованиями показано значение микогенной сенсибилизации в патогенезе аллергического ринита, бронхиальной астмы, аллергических бронхолегочных микозов, экзогенного аллергического альвеолита и атопического дерматита [1-3]. Причиной возникновения аллергических реакций считаются антигенные компоненты, находящиеся на поверхности спор и в составе клеточных стенок, имеющие гликопротеидную природу. Именно поэтому важнейшим источником аллергенов являются мицелиальные грибы, которые образуют споры, легко распространяющиеся в воздушной среде [4].

Несмотря на то, что для борьбы с грибами успешно используется большое количество антимикотиков, разработка новых форм препаратов сохраняет свою актуальность и в настоящее время. Одним из таких веществ является хитозан — биогенный полимер, состоящий из остатков глюкозамина и ацетилглюкозамина [5].

Многочисленные исследования биоцидной активности хитозана в основном сосредоточены на изучении его антибактериальных свойств и антимикотической активности в отношении дрожжевых и дрожжеподобных грибов, тогда как действие хитозана на мицелиальные грибы изучено гораздо в меньшей степени [6, 7].


В связи с вышесказанным целью данного исследования являлась оценка потенциальной антимикотической активности хитозана в отношении мицелиальных грибов.

Материалы и методы

В работе использовали штаммы следующих мицелиальных грибов: Penicillium tardum, Penicillium chrizogenum, Penicillium crustozum, Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Phoma betae, Cladosporium herbarum, Mucor pusillus, Trichoderma harzianum из музея КНИИЭМ. Штаммы грибов поддерживались на агаризованной среде Сабуро.

В работе использовали низкомолекулярный хитозан, полученный с помощью кислотной деполимеризации, со средневесовой молекулярной массой 8,3 кДа, аналогичный используемому в работе [6]. Раствор хитозана стерилизовали посредством фильтрации через мембрану с диаметром пор 0,22 мкм.


Противогрибное действие хитозана исследовали в жидкой среде Сабуро при рН 5,5-5,7. Для этого в среду добавляли раствор хитозана до конечной концентрации 500 мкг/мл. Затем вносили свежеприготовленную суспензию спор грибов в той же среде до конечной концентрации 1-2,5 × 105 спор на 1 мл. После 7 суток инкубации при 30°С оценивали рост культуры и проводили микроскопический анализ.

Результаты и их обсуждение

Рис. 1. Действие хитозана на мицелиальные грибы. Вариант слева — контроль, вариант справа — опыт с хитозаном

untitled-22Было показано, что хитозан в концентрации 500 мкг/мл практически полностью ингибировал рост P. tardum, P. chrizogenum, A. flavus, P. betae и C. herbarum (рис. 1). Рост остальных видов микромицетов полностью не подавлялся, однако были отмечены заметные изменения в количестве биомассы, обилии спороношения, цвете культуры и культуральной жидкости. Так, P. crustozum в присутствии хитозана не образовывал сплошного мицелиального образования на поверхности питательной среды, культуральная среда в отличие от контрольного варианта не приобретала характерную красно-коричневую окраску. A. fumigatus в обоих вариантах имел обильное спороношение, хотя в опыте было отмечено более позднее начало спороношения и меньшее количество биомассы. Аналогичный результат наблюдался и в случае с другим аспергиллом — A. niger, а также мукором и триходермой.

Поскольку A. flavus даже в контрольном варианте через 7 суток показывал незначительный рост, было проведено изучение ингибирующего действия хитозанового полимера на этот микромицет на агаризованной питательной среде того же состава с такой же концентрацией исследуемого вещества. Было обнаружено, что на 7 сутки роста колонии, мицелий гриба по морфологии и характеру роста заметно отличается от контрольного при добавлении в среду хитозана. Нити мицелия укорачивались по длине и утолщались в диаметре, имели неровную структуру, благодаря чему колония приобретала более плотный вид (рис. 2), а сами колонии на твердой питательной среде были меньшего размера.

Рис. 2. Действие хитозана (500 мкг/мл) на морфологию мицелия A. flavus

untitled-32Заключение

Таким образом, показано, что низкомолекулярный хитозан ингибирует рост ряда мицелиальных грибов, имеющих медицинское значение. Полученные результаты указывают на обоснованность проведения дальнейших исследований по выяснению механизма фунгицидного действия полимера на молекулярном уровне с целью создания на их основе препаратов антимикотической направленности.

Работа выполнена при финансовой поддержке регионального гранта Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 09-04-99035 р_офи)

С.Н. Куликов, Р.З. Хайруллин, Ю.А. Тюрин, С.А. Лисовская, Н.И. Глушко, А.Н. Левов, В.П. Варламов

Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань

Центр «Биоинженерия» РАН, Москва

Казанский государственный медицинский университет

Куликов Сергей Николаевич — кандидат биологических наук, соискатель научной степени.


Литература:

1. Kurup V.P., Shen H.-D., Vijay H. Immunobiology of fungal allergens. Int. Arch. Allergy Immunol. 2002; 129: 181 — 188.

2. Zureik M., Neukirch C., Leynaert B., Liard R., Bousquet J., Neukirch F. Sensitisation to airborne moulds and severity of asthma: cross sectional study from European Community respiratory health survey. Brit. Med. J. 2002; 325: 7361: 411 — 414.

3. Lee S.K., Kim S.S., Nahm D.H., Park H.S., Oh Y.J., Park K.J., Kim S.O., Kim S.J. Hypersensitivity pneumonitis caused by Fusarium napiforme in a home environment. Allergy 2000; 55: 12: 1190 — 1193.

4. Елинов. Н.П. ХХХI научная конференция немецкого микологического общества в г. Ахене (Германия) 18-21 сентября 1997 г. Микология и Фитопатология 1999; 2: 130 — 133.

5. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение. Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М.: Изд-во Наука, 2002. 368 с.

6. Куликов С.Н., Лисовская С.А., Глушко Н.И., Левов А.Н., Лопатин С.А., Варламов В.П. Действие низкомолекулярного хитозана в отношении Candida albicans. Практическая Медицина 2009; 3 (35): 69 — 71.

7. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Варламов В.П. Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры. Журнал Микробиологии, Эпидемиологии и Иммунобиологии 2009; 5: 91 — 97.