Генетические прогностические факторы течения неспецифического язвенного колита


В открытом исследовании «случай-контроль» с включением 61 больного с неспецифическим язвенным колитом изучено влияние полиморфизма гена TNFα G-308A на прогноз течения язвенного колита, эффективность терапии стероидами и формирование потребности в цитостатической терапии.

Genetic prognostic factors of course of nonspecific ulcerative colitis 

In open research «case-control» with including 61 patients with an ulcerative colitis influence of polymorphism of gene TNF α G-308A on the prognosis of a course of an ulcerative colitis, efficiency of therapy by steroids and formation of need for cytostatic therapy is studied. 

Неспецифический язвенный колит (НЯК) по тяжести течения, частоте осложнений и инвалидизации трудоспособного населения занимает одно из ведущих мест в структуре болезней пищеварительного тракта [3]. Определение прогноза НЯК является важной задачей на этапе диагностики заболевания, выбора тактики ведения и алгоритма лечения. Зачастую безуспешное патогенетическое лечение ведет к прогрессированию заболевания, развитию грозных для жизни осложнений, таких как кишечное кровотечение, токсическая дилатация и перфорация толстой кишки, колоректальный рак, и риску оперативного лечения с инвалидизацией лиц молодого возраста [8].

В прогностическом аспекте важна оценка течения НЯК в первые 5 лет с момента дебюта, когда определяется характер и тяжесть заболевания, формирование резистентности к базисному лечению, развитие грозных для жизни осложнений [5]. В связи с чем во всем мире активно обсуждается вопрос о внедрении в практику «нисходящей» лечебной тактики – «top-down» стратегии, где антицитокиновые препараты используются в первую очередь, а не являются альтернативой при неэффективности салицилатов, стероидов, иммуносупрессоров при классической стратегии «step-up», имеющей восходящий характер [6, 8, 9, 10].

В последние годы отмечается повышение интереса к исследованию генетических детерминант развития и прогрессирования заболевания и ответа на лекарственную терапию. К числу наиболее широко изучаемых генетических факторов относятся однонуклеотидные полиморфизмы (Single Nucleotide Polymorphism, SNP), которые связаны с точечными заменами или микроделециями и инсерциями в геноме [2, 4]. Считается, что наличие однонуклеотидных замен является одним из факторов, определяющих индивидуальные особенности течения болезни, и их выявление может быть использовано для определения прогноза заболевания.


В настоящее время большой интерес представляет изучение «функционального (ответственного за измененную продукцию) полиморфизма генов» цитокинов и их рецепторов, поскольку именно эти медиаторы вносят наибольший вклад в регуляцию иммунитета [7]. Экспрессия генов цитокинов начинается в ответ на антигенное раздражение или повреждение тканей.

При НЯК отмечается повышенная продукция цитокинов — интерлейкин 1β (IL 1β), IL 5, IL 6, IL 8, IL 13, IL 17, IL 22, фактор некроза опухоли α (TNFα), TL1A. Данные о влиянии полиморфизма генов, кодирующих синтез цитокинов и их рецепторов, постоянно пополняются, остановимся лишь на одном из них.

TNFα – провоспалительный и иммунорегуляторный цитокин, синтезируемый моноцитами, макрофагами и Т-клетками. Ген TNFα, секвенированный и клонированный в 1985 г., локализован на коротком плече 6-й хромосомы, состоит из четырех экзонов. Продукт гена – белок из 157 аминокислот, многофункциональный провоспалительный цитокин. Одним из самых мощных индукторов TNFα считают бактериальные липополисахариды, которые в избытке находятся в просвете кишки как при НЯК, так и при болезни Крона (БК), поэтому нарушение микрофлоры, сопутствующее воспалительным заболеваниям кишечника (ВЗК), может быть причиной его избыточной экспрессии. Полиморфизм промоторной части гена Т/А определяет интенсивность экспрессии TNFα. Активно исследуется полиморфизм гена TNFα в отношении прогноза эффективности терапии. Однако сегодня не обнаружено каких-либо достоверных ассоциаций полиморфизма гена TNFα и ответом на антицитокиновую терапию инфликсимабом. Вероятно, при ВЗК, как и при многих других многофакторных заболеваниях, имеют место т.н. «сцепленные» генетические ассоциации, когда влияние на фенотип патологии реализуется при наличии двух и более полиморфизмов функционально сопряженных генов. И хотя результаты исследований в этой области спорны и противоречивы, что связано с огромным количеством комбинаций полиморфизмов генов-кандидатов, этнической принадлежностью, влиянием внешних факторов, полученные в этой области результаты позволят прогнозировать течение заболевания и ответ на терапию.

Цель исследования


Для оптимизации лечения пациентов с неспецифическим язвенным колитом в открытом исследовании «случай-контроль» изучить генетические прогностические факторы течения заболевания, ассоциированные с потребностью цитостатической терапии.

Материалы и методы исследования

Исследовательскую когорту составил 61 больной в возрасте от 18 до 60 лет с установленным диагнозом НЯК в течение 5 лет и более до включения в исследование, подписавшие информированное согласие на участие в исследовании. Набор пациентов проводился на базах гастроэнтерологических отделений ФГУЗ МСЧ УВД по Омской области, ФГУ «ЗСМЦ МЗ РФ», МУЗ ГБ № 17. Из исследования исключались лица с сопутствующей патологией, влияющей на течение основного заболевания, с осложненным течением заболевания (токсическая дилатация, колоректальный рак, осложения, приведшие к резекции толстой кишки), имеющие низкую комплаентность к лечению (прием менее 90% средств, назначенных врачом).

У всех больных проводилось стандартное клинико-инструментальное обследование. Диагноз устанавливался на основании Монреальской классификации (по распространенности патологического процесса, тяжести заболевания, характеру течения). Генотипирование гена, кодирующего синтез TNFα G-308A, проводилось в Центральной Научно-исследовательской лаборатории Омской государственной медицинской академии (заведущая – д.м.н., профессор Т.И. Долгих). Всем пациентам проводилось молекулярно-генетическое исследование венозной крови, полученной путем пункции локтевой вены и стабилизированной 2,5% раствором ЭДТА в соотношении 10:1 в стерильных пробирках типа «вакутейнер». С использованием комплекса реагентов «SNP-экспресс» (производство компании «Литех», Москва) из лейкоцитарной фракции выделялись образцы геномной ДНК.

Амплификацию участков геномной ДНК, содержащих исследуемые полиморфизмы, проводили на основе технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР). Идентификацию аллельных вариантов, обусловленными точечными нуклеотидными заменами осуществляли с помощью аллель-специфической ПЦР с использованием наборов компании «Литех» (Москва). После амплификации на термоциклере «Терцик» продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. Фрагменты ДНК визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием в концентрации 1 мкг/мл.

Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета прикладных программ «Statistica 6.0 for Windows», «Microsoft Excel» с учетом нормальности распределения признака. Сравнение частот бинарного признака в двух независимых группах проводился с помощью использования таблиц 2*2, рассчитывалось отношение шансов (Odds ratio-OR) и доверительный интервал (CI) для него. Если доверительный интервал не включал 1, различия между группами по изучаемому признаку являлись статистически значимыми. Проверка гипотез осуществлялась с помощью точного критерия Фишера. Достоверными считались различия при р < 0,05; 0,05 ≤ р ≤ 0,15 рассматривали как тенденцию к различию. Распределение генотипов и аллелей находилось в соответствие с распределением Харди-Вайнберга, что свидетельствует о репрезентативности выборки и корректности определения полиморфизма.

Результаты исследования и их обсуждение

В большинстве эпидемиологических исследований по НЯК разницы в частоте заболевания между мужчинами и женщинами получено не было, либо наблюдалось небольшое преобладание мужчин [3, 11], данная особенность отмечена и в наших наблюдениях. Из числа обследованных 28/61 мужчин (45,9%) и 33/61 женщины (54,1%). Средний возраст больных составил 28,96 лет (18-60 лет). Возраст дебюта заболевания у 36/61 (59%) пациентов приходился на 21-35 лет, что соответствует общемировой тенденции [3, 11]. 11/61 (18%) пациентов находятся на инвалидности по основному заболеванию. В нашем исследовании от появления первых симптомов до установления диагноза прошло 3,2 года. В Новосибирске данный показатель для НЯК составил 2,7 года [1].

По протяженности воспалительного процесса среди 61 обследованных пациентов с НЯК с тотальным поражением толстой кишки диагностирован у 19/61 пациентов, в том числе, у одного пациента тотальное поражение с ретроградным илеитом (31,2 %), субтотальным — у 29/61 (47,5 %), дистальный колит у 13/61 больных (21,3 %).

Хроническое непрерывное течение при длительности заболевания 5 лет и более на момент включения в исследование отмечено у 38/61 обследованных больных (62,3%), рецидивирующее у 23/61 пациентов (37,7%). Внекишечные проявления выявлены у 29/61 пациентов (47,5%): афтозный стоматит — у 2/61 (3,3%), узловатая эритема — 1/61 (1,6%), гангренозная пиодермия — 1/61 (1,6%). Данные системные проявления, по литературным данным, относятся к редким, доля выявленных проявлений соответствует общемировым тенденциям. Артропатия отмечена у 13/61 пациентов (21%), поражение печени (аутоиммунный гепатит, транзиторное повышение трансаминаз, гепатомегалия) — 5/61 (8%), желчекаменная — у 9/61 (14,8%), мочекаменная болезнь — у 4/61 (6,6%), которые являются, по литературным данным, более частыми  внекишечными проявлениями [3]

Анализ результатов наших наблюдений показал, что потребность в стероидах в первые 5 лет сформировалась у 30/61 (49.2%) человек, отсутствие таковой у 31/61 (50,8%) человек. По данным американских ученых, потребность в стероидах в первые годы течения заболевания отмечается в 34% случаев [12]. При этом положительный эффект от стероидов в первые 5 лет отмечался у 18/61 (29,5%), тогда как формирование стероидозависимости, стероидорезистентности в первые 5 лет от дебюта среди пациентов с потребнсотью в стероидах в первые 5 лет отмечалось у 12/61 (19,7%). По литературным данным, пролонгированный положительный эффект у пациентов, впервые пролеченных стероидами, наблюдался в 49% случаев, у 22% отмечалось формирование стероидозависимости, у 29% — стероидорезистентности [12].

Для оценки влияния  полиморфизма гена TNFα G-308A на возраст дебюта заболевания все пациенты были разделены на 3 группы: до 20 лет, от 20 до 35 лет включительно и старше 36 лет.

Распределение генотипов TNFα в положении — 308: у 9 пациентов в возрасте дебюта до 20 лет выявлены гомозигота G/G – у 8/9 пациентов (88,9%), гетерозигота G/A — у 1/9 больных (11,1% ), гомозигота А/А — 0. В группе с дебютом заболевания  в возрасте от 20 до 35 лет отмечено 36 пациентов, генотипы которых G/G – у 19/36 (52,8%), G/A у 14/36 больных (38,9%), А/А – 3/36 (8,3%). Дебют заболевания в возрасте 36 лет и старше отмечался у 16 пациентов, у 13/16 из которых гомозигота G/G (81,25%), гетерозигота G/A – у 3/16 (18,75%), гомозигота А/А – не встречалась (0).

При статистической обработке было определено, что у лиц с дебютом заболевания в возрасте 20 до 35 лет отмечается повышение частоты аллеля A (OR 4,42; 95%CI 1,41-13,89) При этом χ² с поправкой по Йетсу 7,30; р=0,007, напротив аллель G является протективной  в отношении дебюта заболевания в молодом возрасте (OR 0,23; 95%CI 0,07-0,71), χ² с поправкой по Йетсу 7,30; р=0,007;

Генотип  G/G гена TNFα -308 ассоциирован со снижением риска дебюта заболевания в возрасте 20-35 лет (OR 0,21; 95% Cl 0,06-0,75), χ² с поправкой по Йетсу 5,06; р=0,024 (табл. 1).

Таблица 1.

Влияние полиморфизма гена TNFα G-308A на возраст дебюта заболевания

Генотипы

Возраст дебюта заболевания 20-35 лет, n=36

Дебют заболевания в других возрастных рамках , n=25

χ² с поправкой по Йетсу, р-уровень значимости

OR, 95% Cl

абс. зн.

%

абс. зн.

%

G/G

19

52,8

21

84

5,06; р=0,024

0,21; 0,06-0,75

G/А

14

38,9

4

16

А/А

3

8,3

0

0

Аллель G

52

72,2

46

92

7,30; р=0,007

0,23; 0,07-0,71

Аллель А

20

27,8

4

8

4,42; 1,41-13,89

 

При генотипировании данного участка полиморфизма гена TNFα c учетом влияния на тяжесть течения заболевания больных с НЯК со сформировавшейся потребностью в стероидах в первые 5 лет течения заболевания генотипы распределились следующим образом: легкое течение отмечено у 20/61 пациентов (32,8%), среди которых гомозигота G/G выявлена у 13/20 (65%), гетерозигота G/А – у 4/20 (20%), гомозигота А/А — у 3/20 (15%); средней тяжести – 29/61 (47,5%), среди которых гомозигота G/G выявлена у 18/29 (62%), гетерозигота G/А – у 11/29 (38 %), гомозигота А/А — не выявлена; тяжелое течение – 12/61 (19,7%), среди которых гомозигота G/G выявлена у 9/12 (75%), гетерозигота G/А – у 3/12 (25%), гомозигота А/А — не выявлена.

Статистический анализ показал отсутствие ассоциации аллелей A, G с тяжестью течения заболевания. В то же время аллель A в гомозиготном состоянии (А/А) по сравнению с гетерозиготным G/A увеличивает риск развития средней тяжести (OR 0.093; 95%Cl 0.004-2.074), χ² с поправкой по Йетсу 3,85; р=0.0497 (табл. 2).

Таблица 2.

Влияние полиморфизма гена TNFα G-308A на тяжесть течения заболевания

Генотипы

Средняя тяжесть, n=29

Легкое, тяжелое течение , n=32

χ² с поправкой по Йетсу, р-уровень значимости

OR, 95% Cl

абс. зн.

%

абс. зн.

%

G/G

18

62

22

68,8

3.85; p=0.04975

0.093; 0.004-2.074

G/А

11

38

7

21,8

А/А

0

0

3

9,4

Аллель G

47

81

51

75

0.03; p=0.85173

1.089; 0.445-2.667

Аллель А

11

19

17

28

0.03; p=0.85173

0.918; 0.375-2.248

 

При изучении распределения генотипов TNFα в положении — 308 в условиях формирования псевдополипов в первые 5 лет от дебюта заболевания выявлено: у 42/61 пациентов (68,9%) с отсутствием признака гомозигота G/G — у 24/42 (57,1%), гетерозигота G/А – у 15/42 (35,7%), гомозигота А/А — у 3/42 (7,2%); у 19/61 пациента (31,1%) отмечалось формирование  псевдополипов в первые 5 лет от дебюта заболевания, при этом гомозигота G/G — у 16/19 (84,2%), гетерозигота G/А – у 2/19 (15,8%), гомозигота А/А — не выявлено.

Носительство аллели A ассоциировано с увеличенным риском формирования псевдополипов в первые 5 лет от дебюта заболевания (OR 5.667; 95% Cl 1.253-25.630), тогда как аллель G является протективной в отношении риска формирования псевдополипов (OR 0.176; 95% Cl 0.039-0.798), χ² с поправкой по Йетсу 6,15; р=0.013

Гомозигота G/G ассоциирована со сниженным риском формирования псевдополипов в первые 5 лет от дебюта заболевания по сравнению с гетерозиготой (OR 0.200; 95%Cl 0.040-0.996), χ² с поправкой по Йетсу 4,40; р=0.036, а так же  по сравнению с гетерозиготой и гомозиготой A/A в совокупности  (OR 0.167; 95%Cl 0.034-0.819), χ² с поправкой по Йетсу 5,71; р=0.017 (табл. 3).

Таблица 3.

Влияние полиморфизма гена TNFα G-308A на риск формирования псевдополипов

Генотипы

Формирование псевдополипов в первые 5 лет от дебюта заболевания, n=19

Отсутствие признака, n=42

χ² с поправкой по Йетсу, р-уровень значимости

OR, 95% Cl

абс. зн.

%

абс. зн.

%

G/G

16

84,2

24

57,1

6.15; p=0.01314

0.200; 0.040-0.996

G/А

2

15,8

15

35,7

А/А

0

0

3

7,2

Аллель G

34

94,4

63

65,6

6.15; p=0.01314

0.176; 0.039-0.798

Аллель А

2

5,6

33

34,4

5.667; 1.253-25.630

 

Ассоциации полиморфизма гена TNFα G-308A с формированием потребности в стероидах, развития стероидозависимости, стероидорезистентности в первые 5 лет от дебюта заболевания не выявлено.

В одном из отечественных исследовании, выполненных на популяции Новосибирска, при анализе полиморфизма -G308А гена TNFα оказалось, что у больных воспалительными заболеваниями кишечника формирование стероидозависимости в 3,7 раза чаще встречается генотип А/А (р = 0,04) и в 1,7 раза реже – генотип G/G (р = 0,03) [1]. Данные различия могут быть обусловлены региональными особенностями популяции в Омске и Омской области.

Однако сегодня не обнаружено каких-либо достоверных ассоциаций полиморфизма гена TNFα и ответом на антицитокиновую терапию инфликсимабом. Вероятно, при ВЗК, как и при многих других многофакторных заболеваниях, имеют место т.н. «сцепленные» генетические ассоциации, когда влияние на фенотип патологии реализуется при наличии двух и более полиморфизмов функционально сопряженных генов.

Выводы

1. У обследованных пациентов полиморфизм гена TNFα G-308A ассоциирован дебютом заболевания в молодом возрасте (20-35 лет).

2. Отмечено влияние полиморфизма гена TNFα G-308A в гомозиготном состоянии по аллелю А на тяжесть течения.

3. Выявлена ассоциация полиморфизма гена TNFα G-308A с увеличенным риском формирования псевдополипов в первые 5 лет от дебюта заболевания.

4. Вероятность влияния полиморфизма гена TNFα G-308A на формирование стероидозависимости, стероидорезистентности в первые 5 лет от дебюта заболевания при средней и тяжелой степени НЯК не выявлена.

5. Учитывая полигенность НЯК, требуется изучение влияния полиморфизмов генов цитокинов для оценки прогноза заболевания, эффективности терапии и разработки алгоритма ведения пациентов с учетом результатов генотипирования.

 

М.А. Макейкина, М.А. Ливзан

Омская государственная медицинская академия 

Макейкина Мария Анатольевна — аспирант курса гастроэнтерологии последипломного образования

 

 

 

Литература:

1. Валуйских Е.Ю. и др. Клинико-генетические аспекты воспалительных заболеваний кишечника // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. — 2008. — Т. 18, № 6. — С. 68-74.

2. Коненков В.И., Смольникова М.В. Структурные основы и функциональная значимость аллельного полиморфизма генов цитокинов человека и их рецепторов // Медицинская иммунология. — 2003. — Т. 5, № 1-2. — С. 11-28.

3. Неспецифические воспалительные заболевания кишечника / Под ред. Г. И. Воробьева, И. Л. Халифа. — М.: Миклош, 2008. — 399 с.

4. Самоходская Л.М., Игнатова Т.М., Абдуллаев С.М., Краснова Т.Н., Некрасова Т.П., Мухин Н.А., Ткачук В.А. Прогностическое значение комбинации аллельных вариантов генов цитокинов и гемохроматоза у больных хроническим гепатитом С // РЖГГК. — 2007. — Т. 2. — С. 50-56.

5. E.F. Stange et al. European evidence-based Consensus on the diagnosis and management of ulcerative colitis: Definitions and diagnosis // Journal of Crohn’s and Colitis (for the European Crohn’s and Colitis Organisation (ECCO)). — 2008. — Vol. 2, № 1. — P. 1-23.

6. Faubion W.A. Step-Up Versus Top-Down: Application of New Biological Agents in Pediatric Inflammatory Bowel Disease // Clinical Gastroenterology and Hepatology. — 2006. — Vol. 4, № 9. — Р. 1094-1096.

7. Balding J. et al. Inflammatory bowel disease: the role of inflammatory cytokine gene polymorphisms // Mediators of Inflammation. — 2004. — Vol. 13, № 3. — P. 181-187.

8. Kornbluth А., D.B. Sachar and The Practice Parameters Committee of theAmericanCollegeof Gastroenterology. Ulcerative Colitis Practice Guidelines in Adults: AmericanCollegeofGastroenterology, Practice Parameters Committee // Am. J. Gastroenterol. — 2010. — Vol. 105. — P. 501-523.

9. Lakatos P.L. Do clinical factors help to predict disease course in inflammatory bowel disease? // World J. Gastroenterol. — 2010. — Vol. 16, № 21. — P. 2600-2603.

10. Sohrabpour A.A., Malekzadeh R., Keshavarzian A. Current therapeutic approaches in inflammatory bowel disease // Curr. Pharm. Des. — 2010. — Vol. 16, № 33. — Р. 3668-3683.

11. The Epidemiology of Alimentary Diseases / ed. by J.M. Duggan, A.E. Duggan. — Netherlands: Springer, 2006. — 242 р.

12. Faubion W.A. et al. The natural history of corticosteroid therapy for inflammatory bowel disease: a population-based study // Gastroenterology. — 2001. — Vol. 121, № 2. — P. 255-260.