Изменения ультраструктуры стромы роговицы после проведения кросслинкинга


Приведены результаты трансмиссионной электронной микроскопии, а также описаны морфологические изменения роговицы человека, развивающиеся после проведения стандартной процедуры кросслинкинга.

Changes in the ultrastructure of the corneal stroma after of crosslinking

The results of transmission electron microscopy were given and describes the morphological changes of the cornea of man, after developing a standard procedure of crosslinking

В настоящее время одним из наиболее распространенных методов лечения кератэктазий становится ультрафиолетовое облучение роговицы с использованием рибофлавина, получивший название кросслинкинга роговичного коллагена. Методика была разработана Тео Зейлером с группой ученых в период с 1994 по1999 г. [1-3]. Метод представляет собой фотополимеризацию стромальных волокон, возникающую в результате комбинированного воздействия фотосенсибилизирующего вещества (рибофлавин, или витамин В2) и ультрафиолетового света. В процессе кросслинкинга рибофлавин под действием ультрафиолетового света выделяет свободные радикалы атомарного кислорода. Под их действием аминокислоты коллагена подвергаются дезаминированию и образуют ковалентные связи между собой, что повышает биомеханические свойства роговицы. Результатом процедуры является стабилизация кератэктазии, а также улучшение кератотопографических показателей и остроты зрения в послеоперационном периоде [4-6].

Различные экспериментальные исследования роговиц, подвергшихся процедуре кросслинкинга, указывают на существенное увеличение «жесткости» роговицы, а также повышение резистентности к ферментативному расщеплению [7].

Целью настоящего исследования была оценка влияния процедуры кросслинкинга на ультраструктуру стромы нормальной роговицы.


 Материалы и методы Исследование проводилось на кадаверных глазах, полученных не более чем через 10 часов после смерти донора в результате отравления этиловым спиртом. На роговицах глаз из первой группы проводилась стандартная методика кросслинкинга, заключавшаяся в полном удалении роговичного эпителия с помощью шпателя, инстилляции на поверхность роговицы 0,1%-ного раствора рибофлавина в течение 10 минут до полного пропитывания стромы с последующим облучением ультрафиолетовым светом длиной волны 370 нМ мощностью 3 мВт/см² в течение 30 минут. Для облучения использовали аппарат EVOLUTION (ООО «Трансконтакт», Россия). Роговицы глаз второй группы оставались интактными и были использованы в качестве контрольных. Далее на глазах обеих групп выкраивали роговичные диски диаметром6 мм, которые затем быстро помещали в 2,5% глутаровый альдегид на50 мМ фосфатном буфере (Na-Na) с pH 7,2 и разрезали в этом растворе на более мелкие сегменты 1х2 мм. Образцы последовательно фиксировали в 2,5%-ном глутаровом альдегиде на100 мМ фосфатном буфере (pH 7,3) в течение 3 часов, в последующий час — в 1,0%-ной осмиевой кислоте. После этого материал подвергали обезвоживанию в спиртах, абсолютном ацетоне и окиси пропилена. Затем материал инфильтрировали в смеси эпоксидной смолы и окиси пропилена до повышения концентрации смолы до 100%, после чего образцы заливали в Эпон (Epon resin, PELCO®). Ультратонкие срезы были приготовлены с помощью алмазного ножа на ультрамикротоме LKB Ultracut III ultramicrotome (Швеция), монтированы на медные и никелевые сетки, покрытые формваровой пленкой. Срезы контрастировали в 2,0%-ном растворе уранил ацетата 20 минут и в растворе цитрата свинца 2 минуты при комнатной температуре [8], и были просмотрены на электронном микроскопе JЕМ 1200 EX (Jeol) в лаборатории микроскопии Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН.

 Результаты

Проведенное исследование показало наличие разволокнения структуры стромы роговиц, подвергавшихся кросслинкингу, а также появление апоптотических кератоцитов только в передней строме на глубине 50-100 мкм (рис. 1), чего не наблюдалось в глубжележащих слоях роговицы. Роговичная строма контрольной группы была без участков разволокнения с наличием интактных кератоцитов на всех уровнях стромы. 

Рисунок 1. Микроснимок трансмиссионной электронной микроскопии: а) в передней строме роговицы после выполнения кросслинкинга визуализируется апоптотический кератоцит (1) с участком разволокнения роговицы (2) (увеличение х5000); б) в передней строме роговицы контрольной группы нормальный кератоцит (1) без участков разволокнения стромы (увеличение х8000) 


Изменения ультраструктуры стромы роговицы после проведения кросслинкинга

На снимках роговиц после коллагенового кросслинкинга с большим увеличением было обнаружено нарушение правильной архитектоники волокон коллагена и увеличение межфибриллярных пространств (рис. 2).

 Рисунок 2. Микроснимок ультраструктуры стромы роговицы: а) нарушение правильной архитектоники волокон коллагена и увеличение межфибриллярных пространств в строме роговицы, подвергавшейся кросслинкингу (трансмиссионная электронная микроскопия, увеличение х100000); б) расположение волокон коллагена в строме роговицы, не подвергавшейся кросслинкингу: наблюдается определенная периодичность расположения с примерно равными межфибриллярными промежутками (трансмиссионная электронная микроскопия, увеличение х100000)

 Изменения ультраструктуры стромы роговицы после проведения кросслинкинга

Выводы

В результате проведенного электронно-микроскопического исследования стромы нормальных роговиц, подвергавшихся процедуре кросслинкинга, было выявлено появление апоптотических кератоцитов и участков разволокнения в передней строме, а также нарушение правильной архитектоники волокон коллагена и увеличение межфибриллярных пространств.

 

В.В. Зотов, В.В. Сальников, Н.А. Поздеева 

Чебоксарский филиал МНТК «Микрохирургия глаза» им. С.Н. Федорова МЗ РФ

Лаборатория микроскопии Казанского института биохимии и биофизики КазНЦ РАН 

Зотов Вадим Валерьевич — врач-офтальмолог 2-го офтальмологического отделения

 

 

 

Литература:

1. Spoerl E., Huhle M., Seiler T. Erhohung der Festigkeit der Horn haut durch Vernetzung // Ophthalmologe. — 1997. — № 94 (12). — Р. 902-6.

2. Spoerl E., Huhle M., Seiler T. Induction of cross-links in corneal tissue // Exp Eye Res. — 1998. — № 66 (1). — Р. 97-103.

3. Spoerl E., Schreiber J., Hellmund K., et al. Untersuchungen zur Verfestigung der Hornhaut am kaninchen // Ophthalmologe. — 2000. — № 97 (3). — Р. 203-6.

4. Agrawal V.B. Corneal collagen cross-linking with riboflavin and ultraviolet: A light for keratoconus: Results in Indian eyes // Indian J Ophthalmol. — 2009. — № 57. — Р. 111-4.

5. Wittig-Silva C., Whiting M., Lamoureux E. A randomized controlled trial of corneal collagen cross-linking in progressive keratoconus: Preliminary results // J Refract Surg. — 2008. — № 24. — Р. S720-5.

6. Vinciguerra P., Albe E., Trazza S. et al. Refractive, topographic, tomographic, and aberrometric analysis of keratoconic eyes undergoing corneal cross-linking // Ophthalmology. — 2009. — № 116. Р. 369-78.

7. Spoerl E., Wollensak G., Seiler T. Increased resistance of cross linked cornea against enzymatic digestion // Curr Eye Res. — 2004. — № 29 (1). — Р. 35-40.

8. Reynolds E.S. The use of lead citrat at high pH as an electron opagu stain in electron microscopy // J. Cell. Biol. — 1963. — № 171. — Р. 208-212.