Изучение влияния фармакологически активных веществ С10 — С18 на натриевую проницаемость клеточной мембраны по изменению скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита


Создание современного конкурентоспособного лекарственного препарата (ЛП) невозможно без глубокого понимания механизмов биофармацевтических процессов, происходящих при взаимодействии компонентов ЛП с биологическими объектами и биологическими поверхностями: белками и клетками крови, сосудами, слизистой, тканью кожи и т.д. Поэтому необходимо всестороннее исследование механизмов взаимодействия вспомогательных и лекарственных веществ (ЛВ) с белками и липидами мембран различных клеток, а также изучение фармакокинетики ЛП для оптимизации состава вспомогательных веществ и способа введения препарата.

Степень фармакологического действия препарата зависит, прежде всего, от количества ЛВ, всасывающегося в организм. В свою очередь на процесс всасывания влияет такой фармацевтический фактор, как лекарственная форма (ЛФ) и путь ее введения, правильный подбор которой создает необходимые условия для высвобождения и транспорта веществ с места введения в область фармакологического действия.

При высвобождении ЛВ из ЛФ немаловажную роль играют также его физико-химические свойства (например, степень дисперсности, растворимость, липофильность и т.д.), природа вспомогательных веществ и их количество, а также эндогенные факторы организма.

Биофармация – наука, изучающая зависимость терапевтического действия ЛП на организм от различных факторов (фармацевтических, биологических и т.д.). Это научная дисциплина фармации, занимающаяся исследованием влияния физических и физико-химических свойств действующих и вспомогательных веществ в ЛП, производимых в различных ЛФ, но в одинаковых дозах, на их терапевтический эффект.

Все фармацевтические факторы, которые оказывают влияние на биологическое действие ЛП, можно разделить на пять групп:


—   физическое состояние ЛВ;

—   простая химическая модификация ЛВ;

—   вспомогательные вещества (их природа, физическое состояние и количество);

—   ЛФ и пути ее введения в организм;


—   технологический процесс.

Многочисленными исследованиями о влиянии ЛФ на терапевтическую эффективность ЛП установлено, что оптимальная активность ЛВ достигается только при его назначении в рациональной лекарственной форме. Кроме того, в этом случае можно избежать многих побочных эффектов ЛП на организм.

Важнейшей задачей при разработке и приготовлении ЛФ является обеспечение оптимальных условий для высвобождения и последующего всасывания субстанции. ЛФ признается соответствующей требованиям скорости высвобождения, если в течение установленного интервала времени из нее переходит в растворяющую жидкость оптимальное количество ЛВ. Следует отметить, что изучение кинетики высвобождения ЛВ in vitro в модельных условиях не может заменить исследования in vivo. Вызвано это различием в механизмах протекающих процессов. Так, при всасывании in vivo вслед за стадией растворения ЛВ следует стадия проникновения через стенки желудка и кишечника. В то же время в условиях in vitro моделируется лишь стадия растворения.

Биологическая доступность методами in vivo устанавливается на лабораторных животных (кроликах, собаках и т.д.). При этом либо определяют содержание ЛВ (метаболитов) в крови, либо устанавливают скорость их выведения с мочой через определенные промежутки времени.

Важнейший этап этих испытаний — количественный анализ. Он усложняется по сравнению с методами in vitro, поскольку приходится анализировать сложную смесь, включающую не только ЛВ или их метаболиты, но и различные соединения, входящие в состав биологических жидкостей. Для анализа фармакокинетических параметров наиболее проблематичным является определение концентрации препарата в месте нахождения в организме. Ошибка, возникающая на этом этапе, сводит на нет дальнейшие исследования.

Высокая точность фармакокинетических исследований достигается с помощью внедрения новых технологий подготовки образцов и экспериментального оборудования (современные хроматографические приборы и т.д.).

Установление биологической доступности методами in vitro основано на корреляционной зависимости между скоростью всасывания и скоростью растворения ЛВ. Поэтому для растворимых веществ метод определения скорости растворения служит основным методом определения эффективности высвобождения ЛВ из ЛФ.

Принцип действия созданных для этого многочисленных приборов заключается в механическом разрушении ЛФ и диффузии ЛВ в воду или другую растворяющую среду, имитирующую биологическую жидкость. По мере высвобождения или после полного высвобождения ЛВ растворяющую жидкость удаляют из прибора. Полученные пробы подвергают анализу, используя химические или физико-химические методы. Аналитический контроль — важнейший этап испытания.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ ООН мерой биологической доступности является отношение (в процентах) количества всосавшегося ЛВ, назначенного в исследуемой ЛФ (А), к количеству всосавшегося того же ЛВ, назначенного в той же дозе, но в виде стандартной ЛФ (Б), т.е.:

БД = (А : Б) • 100.

Чаще всего биодоступность ЛП определяют путем сравнительного изучения изменений концентрации ЛВ в плазме крови при назначении исследуемой и стандартной ЛФ. Если в качестве стандартной ЛФ используется раствор для внутривенного введения (внутривенные инъекции, инфузии), который обеспечивает 100%-ную биодоступность, можно определить абсолютную биодоступность (АБД). Она определяется путем измерения площади под кривой изменения концентрации вещества в плазме или сыворотке крови во времени.

Важным показателем является также относительная биодоступность (ОБД), которая характеризует относительную степень всасывания ЛВ из испытуемого ЛП и препарата сравнения. ОБД определяется для различных серий ЛП при изменении технологии производства и для препаратов, произведенных различными фирмами. Обычно ОБД устанавливают для ЛП при одном и том же пути введения, но можно определять ОБД и при разных путях введения. Для определения ОБД используются данные об уровне содержания ЛВ в крови или его экскреции с мочой после одноразового или многократного введения. Достоверность полученных результатов значительно увеличивается при использовании перекрестного метода исследования, что позволяет устранить различия, связанные с влиянием физиологического и патологического состояния организма на биодоступность ЛВ. ОБД также определяется, чтобы сравнить биодоступность двух различных ЛФ для внесосудистого введения одного и того же лекарственного вещества.

Для препаратов, в значительной мере подвергающихся метаболизму в печени при пероральном приеме, используется понятие общая биодоступность. Это часть принятой внутрь дозы препарата, которая достигла системного кровотока в неизмененном виде и в виде метаболитов, образовавшихся в процессе всасывания в результате пресистемного метаболизма («эффекта первого прохождения»).

Техническое выполнение экспериментов in vitro может быть различно и определяется, главным образом, свойствами включенных препаратов. Резорбционные процессы вследствие индивидуальности каждого препарата и патологии больного различны, поэтому ЛС имеют и разную биодоступность.

Степень влияния ЛФ на процессы всасывания определяется способностью высвобождения активной субстанции из пероральной ЛФ и возможностью контакта со слизистыми желудка, кишечника и взаимодействия с их секретами. Существует два пути транспорта веществ через мембрану клетки: активный  и пассивный. Пассивный транспорт подразделяется на движение ионов по градиенту концентрации и посредством облегченной диффузии, когда для транспортировки ионов используются специфические белки-переносчики клеточной мембраны. Высвободившееся лекарственное вещество достигает поверхности всасывания путем диффузии. Процесс всасывания осуществляется с помощью пассивной диффузии, активного транспорта вещества с белками организма или путем цитоза. Всасываемость лекарственных веществ зависит от структуры клеточной мембраны.

Различают четыре типа клеточных мембран.

  1. Имеющие поры – конвекция и диффузия молекул веществ происходит через заполненные водой поры,
  2. Имеющие поры и полупроницаемые слои – может осуществляться диффузия молекул неэлектролитов с относительно большой молекулярной массой,
  3. Не имеющие пор – могут диффундировать только жирорастворимые неионизированные молекулы,
  4. Без пор – активный транспорт может происходить с помощью молекул специфических веществ-переносчиков, образующих обратимую связь с веществом.

Транспорт крупных и трудно растворимых молекул осуществляется путем пиноцитоза с помощью движения мембраны и образования вокруг частиц ультрамикроскопических пузырьков-вакуолей.

ЛВ, поступающие в кровь любыми путями, разносятся по всему организму и равномерно распределяются во всем объеме крови до установления состояния подвижного равновесия в органах организма.

Для прогнозирования путей биохимического превращения лекарств необходимо учитывать, кроме липофильности, размера и поверхности соответствующей молекулы, также наличие групп, которые могут быть атакованы ферментами, и оптические свойства.

В настоящее время развивается новое направление фармакокинетики — стереофармакокинетика. При изучении биодоступности ЛП наиболее важными являются следующие параметры:

—   максимум (пик) концентрации ЛВ в крови;

—   время достижения максимальной концентрации;

—   площадь под кривой изменения концентрации ЛВ в плазме или сыворотке крови во времени.

Na+-Li+-противотранспорт (Na+-Li+-ПТ) по Canessa M. является примером облегченной диффузии ионов. Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита (МЭ) может быть использован как in vitro модель для определения биодоступности различных ЛП. Na+-Li+-ПТ является лабораторным аналогом Na+-Na+-обмена и, хотя физиологическое и биофизическое значение Na+-Li+-ПТ остается неясным, тем не менее определение скорости Na+-Li+-ПТ является широко используемой методикой для оценки функционального состояния мембран клеток в целом.

Целью данного исследования явилось изучение нового подхода к исследованию биодоступности фармакологически активных веществ С1018 путем оценки их влияния на проницаемость по Na+ МЭ посредством определения скорости Na+-Li+-ПТ. Объектом исследования являлись фармакологически активные вещества С10, С12, С14, С16, С18, обладающие ранозаживляющим, антибактериальным и фунгицидным действиями.

Изучалось влияние различных концентраций этих веществ на скорость Na+-Li+-ПТ в МЭ in vitro. Определение скорости Na+-Li+-ПТ в МЭ (в микромолях лития на 1 литр клеток в час) проводилось по методу M. Canessa, при котором измеряется обмен внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий из среды инкубации.

Концентрацию лития регистрировали методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в эмиссионном режиме. Кровь в количестве 3 мл забирали из вены самотёком в пластиковые пробирки, смоченные гепарином (20 ЕД на 1 мл крови), содержимое перемешивали и пробирки помещали в контейнер с тающим льдом. Исследование состояло из следующих этапов:

1) отделение эритроцитов;

2) промывание эритроцитов;

3) прединкубация (3 часа);

4) промывания эритроцитов;

5) инкубация (1 час);

6) определение концентрации лития;

7) вычисление конечного результата.

Внесение исследуемых препаратов разных концентраций in vitro осуществлялось в среду В (среда с Na+ при 1 часовой инкубации).

Оценка влияния фармакологически активных веществ С10, С12, С14, С16, С18 на проницаемость клеточных мембран по Na+ проводилась путем подбора такой концентрации исследуемых веществ, которая не вызывала бы гемолиз эритроцитов. Подбор концентрации анализируемых веществ осуществлялся разведением исходного раствора. Отсутствие гемолиза определялось визуально. Дальнейшие исследования проводились с разными концентрациями изучаемых веществ: 0,001; 0,005; 0,01; 0,025 и 0,05 μМ. Результаты опытов приведены в таблице 1 и на рисунке 1.

Таблица

Влияние фармакологически активных веществ

С10, С12, С14, С16, С18 на скорость Na+Li+-ПТ в МЭ (в исследованиях  in vitro

(скорость Na+-Li+-ПТ в мкМ Li/л кл/ч, М±m)

Вещес-тво

Исходное значе­ние скорос­ти Na+-Li+-ПТ

Концентрация веществ С1018 в µМ

0,001

0,005

0,010

0,025

0,05

С10

337±5

403±13*

370±4*

322±7

362±5

376±1

С12

337±5

398±15*

350±24*

303±12

322±15

323±15

С14

337±5

430±27*

381±5*

359±7

355±8

343±7

С16

337±5

443±39*

441±42*

369±20

гемолиз

гемолиз

С18

337±5

416±10*

368±4*

327±5

365±14

381±6

* достоверные различия с исходным значением  скорости Na+-Li+-ПТ (р<0,05)

Из таблицы 1 видно, что фармакологически активные вещества С10, С12, С14, С16, С18 увеличили скорость Na+-Li+-ПТ в МЭ, но это увеличение происходило лишь под влиянием их минимальных концентраций, порядка 0,001-0,005 μМ. Под влиянием других концентраций: 0,01-0,025-0,05 μМ скорость Na+-Li+-ПТ изменялась незначительно (p>0,05).

Рис.1. Влияние концентрации фармакологически активных веществ 

С10, С12, С14, С16, С18  на скорость Na+-Li+-противотранспорта в МЭ

Изучение влияния фармакологически активных веществ С10 - С18 на натриевую проницаемость клеточной мембраны по изменению скорости Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита

Наибольшее влияние на проницаемость по Na+ оказала концентрация исследуемых веществ  в  0,001 μМ,  при  этом вещество С10 увеличило скорость Na+-Li+-ПТ в МЭ  с 337 до 403 мкМ Li+, т.е. в 1,2 раза (на 11,9%), вещество С12 – до 398, т.е. в 1,2 раза (на 11,8%), вещество С14 – до 430, т.е. в 1,27 раза (на 12,7%), вещество С16 – до 443, т.е. в 1,3 раза (на 13%), вещество С18 – до 416, т.е. в 1,2 раза (на 12,3%).

Бóльшие концентрации (0,01-0,05 μМ) не оказывают существенного влияния на проницаемость клеточной мембраны по Na+.

Таким образом, результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что фармакологически активные вещества С10, С12, С14, С16, С18, обладающие ранозаживляющим, антибактериальным и фунгицидным действием, влияют на скорость Na+-Li+-ПТ в МЭ. Малые концентрации этих веществ (0,001-0,005 μМ) увеличивают скорость Na+-Li+-ПТ в МЭ в 1,2-1,3 раза, т.е. увеличивают проницаемость клеточной мембраны по Na+.

 

О.В. Орлова, В.Н. Ослопов, С.А. Сидуллина 

Казанский государственный медицинский университет, г. Казань

 

 

Литература:

1. Агафонов А.А. Программа M-IND-оценки системных параметров фармакокинетики модельно–независимым методом статистических моментов / А.А. Агафонов, В.К. Пиотровский / Химико-фармакологический журнал. – 1991. – № 10. – С. 16–19.

2. Березовская И.В. Актуальные проблемы безопасности воспроизведенных лекарственных препаратов / И.В. Березовская, В.М. Иванова / Клинические исследования лекарственных средств в России. – 2004. – № 3–4. – С. 16–23.

3. Бондарева И.Б. Рекомендации по проведению качественных клинических исследова–ний биоэквивалентности лекарственных препаратов / И.Б.Бондарева [и др.]. –  М.: Медицина, 2001. – 128 с.

4. Егорова С.Н. Методы моделирования in vitro чрезкожного всасывания лекарственных средств из лекарственных форм местного действия / С.Н.Егорова // Казанский медицинский журнал, 2000. – Т. LXXXI. – № 2. – С. 146–147.

5. Орлова О.В. Исследование влияния диметилсульфоксида на проницаемость клеточных мембран / О.В. Орлова, С.Н. Егорова,  В.Н. Ослопов // Казанский медицинский журнал, 2011. – Т. XCII. –  № 6. – С. 901–904.