Клинико-патогенетическое значение выявления H.pylori у больных хронической HCV-инфекцией


А.И. ФАЗУЛЬЗЯНОВА, В.Х. ФАЗЫЛОВ

Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49

Фазульзянова Альфия Ильдусовна — кандидат медицинских наук, доцент кафедры инфекционных болезней, тел. (843) 267-80-99, e-mail: al-faz@mail.ru

Фазылов Вильдан Хайруллаевич — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой инфекционных болезней, тел. (843) 267-80-71, e-mail: vildan47@rambler.ru

В статье представлены результаты обследования пациентов с хронической HCV-инфекцией, влияющей на частоту инфицирования H.pylori. Дана клиническая характеристика особенностей этих больных. Проведена сравнительная оценка эффективности инвазивных и неинвазивного методов диагностики хеликобактериоза.


Ключевые слова: хроническая HCV-инфекция, H.pylori, дыхательный тест «Хелик», уреазный тест «Хелпил», ПЦР ureC H.pylori

 

A.I. FAZULZYANOVA, V.Kh. FAZYLOV

Kazan State Medical University, 49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420012 


Clinico-pathogenetic importance of H.pylori detection in patients with chronic HCV-infection

Fazulzyanova A.I. — Cand. Med. Sc., Associate Professor of the Department of Infectious Diseases, tel. (843) 267-80-99, e-mail: al-faz@mail.ru

Fazylov V.Kh. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Infectious Diseases, tel. (843) 267-80-71, e-mail: vildan47@rambler.ru

The article presents results of a survey of patients with chronic HCV-infection on the incidence of H.pylori infection. Clinical features of these patients are characterized. A comparative evaluation of the effectiveness of invasive and non-invasive diagnostic methods of Helicobacter Pylori infection is done.

Key words: chronic HCV-infection, H.pylori, «Helik» breath test, «Helpil» urease test, PCR of ureC H.pylori.

 

Распространенность в популяции, высокая частота хронизации, широкий спектр клинических вариантов и исходов заболевания — от неактивного носительства с низким уровнем виремии до хронического гепатита с выраженной активностью и возможностью формирования неблагоприятных исходов (цирроза печени (ЦП) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) позволяют рассматривать в настоящее время вирусный гепатит С как приоритетную проблему современной медицины.

Хроническая инфекция H.pylori является одной из самых распространенных — до 50% популяции в развитых странах и до 90% — в развивающихся [1-3]. С 1983 г., когда впервые был выделен в культуре австралийскими учеными B.J. Marshall и R. Warren новый вид микроорганизма — Helicobacter pylori (H.pylori) [4], многочисленными исследованиями доказана его роль в развитии хронического атрофического гастрита (90-100%), язвенной болезни желудка (70-80%) и двенадцатиперстной кишки (90-100%), аденокарциномы (80%) и мальтомы желудка (40-75%) [5-8]. Установление связи между инфицированностью H.pylori и раком желудка дало основание Международному агентству по изучению рака отнести его к канцерогенам I группы [9].

Показана связь между инфекцией H.pylori и поражением других органов и систем. Значение H.pylori интенсивно изучается при гепатобилиарной патологии. Предполагается, что у людей H.pylori является кофактором развития гепатита, обусловленного вирусом гепатита С (HCV), и формирования тяжелых исходов: оба этих возбудителя оказывают патогенное воздействие на эпителий желудка и желчных протоков печени, вплоть до злокачественной трансформации [10-15].

Несмотря на большое количество исследований, посвященных выявлению инвазии этого микроорганизма в организме человека, ключевым моментом продолжает оставаться отсутствие быстрых, чувствительных и простых диагностических методов, необходимых для скрининга, длительного мониторирования и многократных неинвазивных исследований, которые позволили бы определять не только наличие H.pylori в организме, но и его способность экспрессировать факторы патогенности, обусловливающие развитие и исход заболевания [16, 17]. В связи с этим изучение микст-инфекции (HCV, ассоциированной с H.pylori), отсутствие алгоритма скрининга и мониторинга хеликобактериоза в группах, инфицированных HCV, определяют актуальность данного исследования.

Цель — установить частоту инфицирования H.pylori у больных хронической HCV-инфекцией с последующей сравнительной оценкой эффективности инвазивных и неинвазивного методов диагностики хеликобактериоза.

Материал и методы

Исследования проведены на базе гепатологического отделения Республиканской клинической инфекционной больницы А.Ф. Агафонова г. Казани. Были обследованы 25 больных (мужчин — 16, женщин — 9) с хронической HCV-инфекцией в возрасте от 19 до 64 лет (средний возраст — 39,4 года). Срок инфицирования, определяемый по первому положительному результату скрининга на HCV-инфекцию, у пациентов варьировал от 1 до 16 лет: до 5 лет — 25%, от 5 до 10 лет — 35%, более 10 лет — 40%, в среднем составил 8,8 года. Эпидемиологический анамнез, указывающий на вероятный путь инфицирования, оказался информативным в 76%. В 16% случаев инфицирование наступало в результате внутривенного употребления наркотических средств, в 84% — медицинским путем (гемотрансфузии и оперативные вмешательства — по 37%, стоматологические процедуры — 10%). С учетом информативности эпидемиологического анамнеза удалось установить предполагаемую длительность заболевания: до 10 лет — у 4 пациентов (21%), от 10 до 20 лет — у 7 (37%), от 20 до 30 — у 2 (10%), от 30 до 40 — у 6 (32%) и в среднем составил 19,9 года.

Обследование пациентов осуществлялось с использованием стандартных диагностических методов. Активность хронической HCV-инфекции определялась репликацией HCV и уровнем сывороточной аланинаминотрансферазы (АлАТ). В 96% случаев хроническая инфекция протекала в репликативной форме. Количественное определение вирусной нагрузки было выполнено только у 20% пациентов (низкая — в 20% случаев, высокая — в 80%). Выраженность воспалительного процесса характеризовалась гиперферментемией в 2-3N у 25% больных, 3-4N — у 20%, 4-5N — у 25%, 5-6N — у 10%, более 6N — у 10% (N — среднее значение нормы АлАТ, равное у мужчин 22,61±1,26 ЕД/л, у женщин — 19,23±1,27 ЕД/л). В 48% случаев было диагностировано формирование цирроза печени в исходе хронического гепатита С.

Всем больным была выполнена фиброэзофагогастродуоденоскопия (ФЭГДС) с биопсией слизистой оболочки антрального отдела желудка (СОЖ) и двенадцатиперстной кишки (ДПК). Варикозное расширение вен пищевода I, II, III степеней, указывающее на портальную гипертензию за счет формирования цирроза печени, было установлено у 40% больных.

Среди всего многообразия методов диагностики H.pylori выделяют две большие группы — инвазивные и неинвазивные методы. Инвазивные основаны на взятии биоптатов при проведении фиброгастродуоденоскопии, неинвазивные не требуют проведения эндоскопического исследования. На практике выбор конкретного метода в большинстве случаев определяется клиническими особенностями заболевания и доступностью тех или иных тестов. Основными характеристиками различных методов диагностики являются чувствительность и специфичность. Чувствительность метода — это вероятность получения с его помощью истинно положительного результата, специфичность метода — вероятность получения истинно отрицательного результата. До настоящего времени не разработан универсальный метод диагностики H.pylori, который бы достиг 100% чувствительности и специфичности. Каждый метод обладает свойственными ему преимуществами и недостатками, а также особенностями, которые определяют его место и показания к применению в клинической практике [18].

Так, до проведения диагностической ФЭГДС пациентам был проведен дыхательный тест для определения H.pylori по составу выдыхаемого воздуха с помощью тест-системы «Хелик» (АМА, г. Санкт-Петербург) индикаторными трубками. Диагностика H.pylori в биоптатах проводилась уреазным тестом (Хелпил-тест, ООО «АМА», Россия). Для молекулярно-генетического исследования использованы биоптаты ДПК, выделение ДНК из биопроб производили сорбционным способом с использованием набора «Хеликопол» (НПФ «Литех», г. Москва) в соответствии с рекомендациями производителя. Молекулярно-генетическое исследование включало амплификацию специфических фрагментов генома H.pylori. Определяемыми фрагментами ДНК являлись гомологичные участки гена ureC H.pylori. Кроме того, проводился анализ положительного и отрицательного (деионизированная вода) контрольных образцов для оценки чистоты эксперимента и исключения возможности контаминации [19].

Оценка результатов осуществлялась следующим образом: H.pylori инфекцию считали выявленной у пациента по положительным результатам двух тестов, H.pylori, инфекция отсутствовала при всех отрицательных тестах или положительном результате только одного из них, чувствительность рассчитывали по формуле: чувствительность = истинно-положительный результат/(истинно-положительный результат + истинно-отрицательный результат).

Результаты и их обсуждение

При эндоскопическом исследовании у всех больных выявлялся гастробульбит (в 32% — эрозивного характера), в 36% случаев — хронический рефлюкс-эзофагит, в 32% — дуоденогастральный рефлюкс, в 4% — острая язва желудка.

Дыхательный тест для определения H.pylori по составу выдыхаемого воздуха с помощью тест-системы «Хелик» с индикаторными трубками был расценен как положительный у 52% пациентов. При исследовании биоптатов СОЖ и ДПК Хелпил-тестом уреазная активность была выявлена во всех образцах. При исследовании биоптатов антрального отдела СОЖ выраженная и умеренная степень инфицирования H.pylori была обнаружена с одинаковой частотой — в 48% образцов. При исследовании биоптатов ДПК преобладала умеренная степень инфицирования — в 60% образцов, высокая степень наблюдалась в 2 раза реже — в 32% случаев. В образцах как СОЖ, так и ДПК низкая степень инфицирования H.pylori выявлена в единичных случаях — в одном образце СОЖ (4%) и двух образцах ДПК (8%). Специфичность уреазного теста была подтверждена молекулярно-генетическим методом. Чувствительность уреазного теста и молекулярно-генетического составили 100%, дыхательного теста — 67,6% [19].

К недостаткам всех уреазных тестов в целом следует отнести косвенную, а не прямую сущность метода, т.е. обнаружение не H.pylori как такового, а лишь его уреазной активности. При невысокой степени обсемененности слизистой оболочки желудка (СОЖ) суммарная уреазная активность может быть также невысокой, поэтому метод может дать ложноотрицательный результат. Кроме того, уреазные тесты могут давать ложноотрицательные результаты при наличии уреазонегативных штаммов H.pylori и ложноположительные — при наличии других уреазопродецирующих бактерий (протей, псевдомонады, стрептококки, грибы рода Candida и др.). Чувствительность уреазных тестов значительно снижается при желудочно-кишечном кровотечении [20]. Согласно рекомендациям производителя, при проведении Хелик-теста необходима предварительная подготовка пациента к исследованию (отказ за день проведения от употребления алкоголя, курения, специальная диета и т.д.). Низкая эффективность дыхательного теста у больных HCV-инфекцией может быть объяснена также особенностью контингента больных, не всегда выполняющих рекомендации врачей по подготовке к исследованиям.

По результатам Хелпил-теста и молекулярно-генетического исследования больных вирусным гепатитом С выявлена 100%-ная инфицированность H.pylori. При этом обнаружена строгая ассоциация между желудочной и дуоденальной колонизацией этим микроорганизмом. Выявленная уреазная активность в биоптатах антрального отдела желудка и области луковицы 12-перстной кишки, подтвержденная выявлением гена ureC H.pylori, доказывает жизнеспособность этой бактерии в 12-перстной кишке и указывает на возможность дуоденального (восходящего) пути колонизации органов гепатобилиарной системы [19]. Полученные результаты коррелируют с результатами других исследований, где показана достоверно более высокая инфицированность H.pylori у больных хроническим вирусным гепатитом С по сравнению с неинфицированными HCV, при этом частота инфицирования хеликобактером достоверно повышалась при прогрессировании от острой формы в хроническую, цирроз и ГЦК [21-23].

Механизмы бактериально-вирусного взаимодействия до конца неясны, но высказаны предположения о влиянии белков хеликобактеров на вирусный геном с последующим развитием злокачественной трансформации клеток [24], способности хеликобактеров вырабатывать гепатоспецифичный токсин, вызывающий некроз гепатоцитов in vitro [25] и повреждение паренхимы печени in vivo [26]. Возможно, эффективная эрадикация будет способствовать снижению риска формирования циррозов и ГЦК у больных HCV, что в свою очередь повысит качество и продолжительность жизни больных.

Таким образом, анализ полученных результатов показывает, что у больных хронической HCV-инфекцией с длительным инфицированием, сформировавшимся циррозом или повышенным риском его развития и ГЦК, проблема хеликобактериоза является более чем актуальной. Во всех случаях с инфекцией H.pylori ассоциирована гастродуоденальная патология.

«Хелпил-тест», основанный на обнаружении уреазной активности в биоптатах СОЖ и ДПК, показал наибольшую эффективность и может быть рекомендован для скрининга и мониторинга хеликобактериоза при коинфекции c вирусом гепатита С.

Следует полагать, что широкое внедрение скрининговых методов диагностики необходимо для эффективной эрадикационной терапии и мониторинга H.pylori инфекции и снижения онкологических рисков у больных хроническими вирусными гепатитами.

 

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Graham D.Y. Helicobacter pylori infection in the pathogenesis of duodenal ulcer and gastric cancer: a model // Gastroenterology. — 1997. — Vol. 113. — P. 1983-1991.

2. Лазебник Л.Б., Васильев Ю.В и др. Helicobacter pylori: распространенность, диагностика, лечение // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2010. — № 2. — С. 3-7.

3. Цуканов В.В. Клинико-эпидемиологические аспекты Helicobacter pylori // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2006. — № 1. — С. 24-25.

4. Warren J.R., Marshall B.J. Unindentified curved bacilli on gastric epithelium in chronic gastritis // Lancet. — 1983. — Vol. 1. — P. 1273-75.

5. Forman D: The prevalence of Helicobacter pylori infection in gastric cancer. Aliment. Pharmacol. Ther. — 1995. — Vol. 9 (Suppl 2). — Р. 71-76.

6. Axon A.T.R. Relationship between Helicobacter pylori gastritis, gastric cancer and gastric acid secretion // Advances in medical sciences. — 2007. — Vol. 52. — P. 55-60.

7. Correa P., Houghton J. Carcinogenesis of Helicobacter pylori // Gastroenterology. — 2007. — Vol. 133. — P. 659-672.

8. Ивашкин В.Т., Шептулин А.А., Лапина Т.Л. Хронический гастрит, вызванный инфекцией Helicobacter pylori: диагностика, клиническое значение, прогноз. Пособие для врачей. — Москва, 2009. — 24 с.

9. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenesis Risks to Humans. Monographs. — Lyon, 1994. — Vol. 61. — P. 177-240.

10. Ponzetto A., Pellicano R., Pedaelli A. et al. Helicobacter pylori infection in patients with hepatitis C virus positive chronic liver diseases // Microbiologie. — 2003. — Vol. 26. — P. 321-328.

11. Konturek S.J., Gonciarz M., Gonciarz Z. et al. Progastrin and its products from patients with chronic viral hepatitis and liver cirrhosis // Scand. J Gastroenterol. — 2003. — Vol. 38. — P. 643-647.

12. Stalke P., Abu Al-Soud W., Bielawski K.P. et al. Detection of Helicobacter species in liver and stomach tissues of patients with chronic liver disease using polymerase chaine reaction— denauring gradient gel electrophoresis and immunohistochemistry // Scand. J. Gastroenterol. — 2005. — Vol. 40. — P. 1032-1041.

13. Pellicano R., Leone N., Berrutti M. et al. Helicobacter pylori seroprevalence in hepatitis C virus positive patients with cirrhosis // Journal Hepatology. — 2000. — Vol. 33. — P. 648-650.

14. Mamun-Al-Mahtab. State of Globe: Helicobacter pylori and hepatitis C together hamper health // Glob Infect Dis. — 2010. — Vol. 2 (1). — P. 1-3.

15. Dore M.P., Realdi G., Mura D. et al Helicobacter infection in patients with HCV-related chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma // Dig. Dis. Sci. — 2002. — Vol. 47 (7). — P. 1638-1643.

16. Лапина Т.Л. Основные принципы диагностики Helicobacter pylori. — М.: Триада-Х, 1999. — С. 107-117.

17. Логинов А.С., Ильченко А.А., Мукамолова Г.В. и др. Сравнительная эффективность различных методов обнаружения Helicobacter pylori у больных язвенной болезнью // Российский гастроэнтерологический журнал. — 1998. — № 3. — С. 3-11.

18. Паролова Н.И., Корниенко Е.А., Дмитриенко М.А. Сравнительная оценка эффективности современных методов диагностики инфекции Helicobacter pylori // Педиатрия. — 2008. — № 1. — С. 4-8.

19. Исаева Г.Ш. Хеликобактериоз у больных хроническим гепатитом С // Фундаментальные исследования. — 2012. — Часть 2. — № 12. — С. 266-269.

20. Westblom TU. Molecular diagnosis of Helicobacter pylori // Immunol. Invest. — 1997. — Vol. 92 (8). — Р. 1310-5.

21. El-Masry S., El-Shamat M., Badra G. et al. Helicobacter pylori and hepatitis C virus coinfection in Egyptian patients // J. Glob. Infect. Dis. — 2010. — Vol. 1 (2). — P. 4-9.

22. Esmat G., El-Bendary M., Zakarya S. et al. Role of Helicobacter pylori in patients with HCV-related chronic hepatitis and cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma: possible association with disease progression // J. Viral. Hepat. — 2012. — Vol. 19 (7). — P. 473-479.

23. Rocha M., Avenaud P., Menard A. et al. Association of Helicobacter species with hepatitis C cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma // Gut. — 2005. — Vol. 54. — P. 396-401.

24. Suganuma M., Kurusu M., Okabe S. et al. Helicobacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 6356-6359.

25. Ito K., Yamaoka Y., Ota H., El-Zimaity H., Graham D.Y. Adherence, internalization, and persistence of Helicobacter pylori in hepatocytes // Dig. Dis. Sci. — 2008. — Vol. 53 (9). — P. 2541-2549.

26. Tian X.F., Fan X.G., Huang X., Fu C.Y., Dai H., Huang Y. A two-year animal experimental study on the pathological effects of Helicobacter pylori on liver tissues // Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. — 2008. — Vol. 16 (2). — P. 129-33.

 

 

REFERENCES

1. Graham D.Y. Helicobacter pylori infection in the pathogenesis of duodenal ulcer and gastric cancer: a model, Gastroenterology, 1997, vol. 113, pp. 1983-1991.

2. Lazebnik L.B., Vasil’ev Yu.V et al. Helicobacter pylori: prevalence, diagnosis, treatment. Eksperimental’naya i klinicheskaya gastroenterologiya, 2010, no. 2, pp. 3-7 (in Russ.).

3. Tsukanov V.V. Clinical and epidemiological aspects of Helicobacter pylori. Eksperimental’naya i klinicheskaya gastroenterologiya, 2006, no. 1, pp. 24-25 (in Russ.).

4. Warren J.R., Marshall B.J. Unindentified curved bacilli on gastric epithelium in chronic gastritis. Lancet, 1983, vol. 1, pp. 1273-75.

5. Forman D: The prevalence of Helicobacter pylori infection in gastric cancer. Aliment. Pharmacol. Ther., 1995, vol. 9 (Suppl 2), pp. 71-76.

6. Axon A.T.R. Relationship between Helicobacter pylori gastritis, gastric cancer and gastric acid secretion. Advances in medical sciences, 2007, vol. 52, pp. 55-60.

7. Correa P., Houghton J. Carcinogenesis of Helicobacter pylori. Gastroenterology, 2007, vol. 133, pp. 659-672.

8. Ivashkin V.T., Sheptulin A.A., Lapina T.L. Khronicheskiy gastrit, vyzvannyy infektsiey Helicobacter pylori: diagnostika, klinicheskoe znachenie, prognoz. Posobie dlya vrachey [Chronic gastritis caused by infection of Helicobacter pylori: diagnosis, clinical significance, prognosis. Manual for physicians]. Moscow, 2009. 24 p.

9. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenesis Risks to Humans. Monographs. Lyon, 1994. Vol. 61. Pp. 177-240.

10. Ponzetto A., Pellicano R., Pedaelli A. et al. Helicobacter pylori infection in patients with hepatitis C virus positive chronic liver diseases. Microbiologie, 2003, vol. 26, pp. 321-328.

11. Konturek S.J., Gonciarz M., Gonciarz Z. et al. Progastrin and its products from patients with chronic viral hepatitis and liver cirrhosis. Scand. J Gastroenterol., 2003, vol. 38, pp. 643-647.

12. Stalke P., Abu Al-Soud W., Bielawski K.P. et al. Detection of Helicobacter species in liver and stomach tissues of patients with chronic liver disease using polymerase chaine reaction – denauring gradient gel electrophoresis and immunohistochemistry. Scand. J. Gastroenterol., 2005, vol. 40, pp. 1032-1041.

13. Pellicano R., Leone N., Berrutti M. et al. Helicobacter pylori seroprevalence in hepatitis C virus positive patients with cirrhosis. Journal Hepatology, 2000, vol. 33, pp. 648-650.

14. Mamun-Al-Mahtab. State of Globe: Helicobacter pylori and hepatitis C together hamper health. Glob Infect Dis., 2010, vol. 2 (1), pp. 1-3.

15. Dore M.P., Realdi G., Mura D. et al Helicobacter infection in patients with HCV-related chronic hepatitis, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Dig. Dis. Sci., 2002, vol. 47 (7), pp. 1638-1643.

16. Lapina T.L. Osnovnye printsipy diagnostiki Helicobacter pylori [Basic principles of diagnosis Helicobacter pylori]. Moscow: Triada-Kh, 1999. Pp. 107-117.

17. Loginov A.S., Il’chenko A.A., Mukamolova G.V. et al. Comparative efficacy of different methods for detection of Helicobacter pylori in patients with peptic ulcer. Rossiyskiy gastroenterologicheskiy zhurnal, 1998, no. 3, pp. 3-11 (in Russ.).

18. Parolova N.I., Kornienko E.A., Dmitrienko M.A. Comparative evaluation of the effectiveness of modern methods of diagnosis of infection with Helicobacter pylori. Pediatriya, 2008, no. 1, pp. 4-8 (in Russ.).

19. Isaeva G.Sh. Helicobacter pylori infection in patients with chronic hepatitis C. Fundamental’nye issledovaniya, 2012, part 2, no. 12, pp. 266-269 (in Russ.).

20. Westblom TU. Molecular diagnosis of Helicobacter pylori. Immunol. Invest., 1997, vol. 92 (8), rr. 1310-5.

21. El-Masry S., El-Shamat M., Badra G. et al. Helicobacter pylori and hepatitis C virus coinfection in Egyptian patients. J. Glob. Infect. Dis., 2010, vol. 1 (2), pp. 4-9.

22. Esmat G., El-Bendary M., Zakarya S. et al. Role of Helicobacter pylori in patients with HCV-related chronic hepatitis and cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma: possible association with disease progression. J. Viral. Hepat., 2012, vol. 19 (7), pp. 473-479.

23. Rocha M., Avenaud P., Menard A. et al. Association of Helicobacter species with hepatitis C cirrhosis with or without hepatocellular carcinoma. Gut, 2005, vol. 54, pp. 396-401.

24. Suganuma M., Kurusu M., Okabe S. et al. Helicobacter pylori membrane protein 1: a new carcinogenic factor of Helicobacter pylori. Cancer Res., 2001, vol. 61, pp. 6356-6359.

25. Ito K., Yamaoka Y., Ota H., El-Zimaity H., Graham D.Y. Adherence, internalization, and persistence of Helicobacter pylori in hepatocytes. Dig. Dis. Sci., 2008, vol. 53 (9), pp. 2541-2549.

26. Tian X.F., Fan X.G., Huang X., Fu C.Y., Dai H., Huang Y. A two-year animal experimental study on the pathological effects of Helicobacter pylori on liver tissues. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi., 2008, vol. 16 (2), pp. 129-33.