Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой


Статья посвящена исследованию клинико-функциональной характеристики пациентов с легкой и тяжелой формами атопической бронхиальной астмы, а также изучению морфологических и биохимических особенностей апоптотической активности Т-лимфоцитов больных в процессе культивирования. Характер апоптотических изменений лимфоцитов в группе с легкой АБА совпадает с группой контроля. В группе с тяжелой АБА отмечено увеличение содержания лимфоцитов с ранними проявлениями апоптоза под влиянием дексаметазона. Впервые для изучения влияния дексаметазона на лимфоциты был применен метод атомно-силовой микроскопии, показавший изменения в топографии клеток.

Apoptotic features of lymphocytes in patients with mild and severe atopic bronchial asthma

The article presents the study of clinical and functional characteristics of patients with mild and severe forms of atopic asthma, as well as the study of morphological and biochemical features of apoptotic activity of T-lymphocytes of patients in the process of cultivation. Apoptotic changes of lymphocytes in the mildABAand control group are the same. In the group with severe asthma dexamethasone increases the content of lymphocytes with early manifestations of apoptosis. In the first time for the study of dexamethasone effect on lymphocytes   used the method of atomic force microscopy which showed changes in the topography of the cells. 

Основным принципом функционирования физиологических систем является поддержание биологической целостности организма. На клеточном уровне данный процесс реализуется за счет регуляторного влияния эфферентных сигналов, которые поддерживают сложное состояние равновесия между физиологическими процессами: пролиферацией, дифференцировкой и программируемой клеточной гибелью (ПКГ) или апоптозом [1,2]. Исследование апоптоза в данном контексте представляется актуальным. Апоптоз, как правило, определяется как генетическая программа, которая элиминирует стареющие или поврежденные клетки. Установлено, что нарушение регуляции апоптоза наблюдается при различных заболеваниях [3]. Апоптоз — одна из форм ПКГ с характерными морфологическими и биохимическими признаками, среди которых накопление фосфатидилсерина во внешнем монослое цитоплазматической мембраны, конденсация хроматина, фрагментация ДНК, распад клеток на апоптозные тельца являются наиболее значимыми [1].

В последние годы появляется все больше доказательств, подтверждающих важную роль апоптоза клеток в развитии воспаления дыхательных путей при бронхиальной астме (БА) [4, 5]. Показана связь между активностью воспаления и тяжестью клиники астмы [6]. Персистенцию аллергического воспаления при БА некоторые авторы связывают с усилением выживаемости Т-лимфоцитов и утратой ими способности к апоптозу, что способствует концентрации мононуклеарных клеток, в том числе лимфоцитов, в зоне воспаления. [4].

Целью данной работы является характеристика морфо-биохимических особенностей апоптотической активности Т-лимфоцитов при атопической бронхиальной астме (АБА) разной степени тяжести.


Материалы и методы

В исследование были включены 20 пациентов с АБА легкого (1 группа) и тяжелого течения (2 группа) в возрасте от 19 до 45 лет, госпитализированных в пульмонологическое отделение Республиканской клинической больницы г. Казани. Диагноз и степень тяжести БА устанавливали в соответствии с критериями «Глобальной стратегии диагностики, профилактики и лечения астмы» (GINA, 2008). Группу контроля составили 10 практически здоровых волонтеров, сопоставимых по полу и возрасту, без БА и других атопических заболеваний.

Критерии включения в исследование:

— отсутствие базисной терапии АБА в течение последних 2 недель,


— информированное согласие на обследование.

Критерии исключения:

— наличие сопутствующей патологии со стороны других органов и систем,

— курение.

Всем больным проводилось общеклиническое обследование, включавшее общий анализ крови с подсчетом лейкоцитарной формулы, иммунограмму, рентгенографию органов грудной клетки, электрокардиографию, исследование функции внешнего дыхания (ФВД) методом спирометрии (аппарат АД О3-М, г. Казань) с определением объемных (ЖЕЛ, ФЖЕЛ) и скоростных параметров (ОФВ1, ПОС, МОС25, МОС50, МОС75, СОС25-75).

Программа специфического аллергологического обследования включала: анализ аллергологического анамнеза, проведение кожного тестирования с группами бытовых, эпидермальных, пыльцевых аллергенов (производство ОАО «Биомед» им. И.И. Мечникова г. Москва, ГП «Аллерген» г. Ставрополь), определение уровня общего и специфических IgЕ в сыворотке крови методом твердофазного ИФА (ЗАО «ДИАплюс», Москва).

Получение крови. Забор крови осуществлялся путем венопункции кубитальной вены в объеме 3 мл. Периферическую кровь из локтевой вены отбирали в пробирку, содержащую гепарин – Na (EUROTUBO, Spain) и использовали для исследований в течение 3 часов.

Выделение Т-лимфоцитов. Лимфоциты выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколл (ρ = 1,077). Для получения чистой популяции Т-лимфоцитов использовали метод иммуномагнитной сепарации (Dynabeads Untouched Human T cells, Dynal, Invitrogen). Подсчет клеток, окрашенных 0,1% раствором трипанового синего, проводили в камере Горяева,

Культивирование лимфоцитов. Лимфоциты (2×106кл./мл.) суспендировали в среде RPMI 1640, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (10%), пенициллин/стрептомицин (5000 ед/мл/5000 мкг/мл) и L-глутамин (1%). Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе (с 5 %-ным СО2) в течение 6 суток. В качестве индуктора апоптоза использовали дексаметазон (конечная концентрация 10-4 М). Оценку апоптоза лимфоцитов осуществляли методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACSСalibur (“Весton Dickinson”, США).

Исследование Т-лимфоцитов методом трансмиссионной электронной микроскопии. Для изучения морфологии лимфоцитов использовали метод электронной микроскопии. После центрифугирования полученный осадок из лимфоцитов фиксировали в 2,5 %-ном растворе глутарового альдегида в течение 1-2 ч. Для фиксации (при 4°С) готовили свежий раствор глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2 и 1 % раствор ОsO4 на том же буфере с добавлением сахарозы (25 мг/мл) (2 ч), затем обезвоживали в ацетоне и окиси пропилена и заливали в Epon-812.

Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме «Ultratom III» (ЛКБ, Швеция). Срезы контрастировали уранил ацетатом и цитратом свинца. Препараты просматривались на электронном микроскопе Hitachi -125 (Япония).

Исследование Т-лимфоцитов методом атомно-силовой микроскопии. Суспензию Т-лимфоцитов помещали на предметное обезжиренное стекло и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После инкубации стекло промывали MQ водой несколько раз. Сканирование клеток на атомно-силовом микроскопе проводилось после полного высыхания препаратов. Исследование поверхности клеток проводили на сканирующей зондовой нанолаборатории ИНТЕГРА ПРИМА (“НТ-МДТ”, Россия) в полуконтактном режиме на воздухе при комнатной температуре.

Результаты

Клинико-функциональная характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл. 1.

Таблица 1.

Клинико-функциональная характеристика пациентов, включенных в исследование

Показатель

Легкая АБА

(n=10)

Тяжелая АБА

(n=10)

Возраст, годы

20,71±1,6

33,0±12,5

Длительность заболевания, годы

11,6±3,6

23,3±8,06

Частота дневных симптомов**

0,17± 0,04

3,9 ±1,8*

Частота ночных симптомов**

0,03±0,05

2,6±0,7*

Потребность в ß2-агонистах***

0,2± 0,09

6,5 ±2,6*

IgE общий, МЕ/мл

189,4±42,3

447,8±36,7

ЖЕЛ, % от должного

94,14±10,36

61,0±13,57*

ФЖЕЛ, % от должного

92,28±9,16

60,0±10,0*

ОФВ1, % от должного

89,42±9,55

37,33±11,0*

ОФВ1/ЖЕЛ, % от должного

96,28±4,02

62,33±20,0*

ПОС, % от должного

80,0±17,51

23,66±7,37*

*  р <0,05 по сравнению с показателями при легкой АБА;

**среднее количество симптомов в сутки по данным за последнюю неделю;

*** количество ингаляций в сутки

Ведущим синдромом у всех больных были приступы экспираторного удушья, дневные и ночные, часто кашель сухой или с трудноотделяемой мокротой. Все больные в 1 и 2 группах предъявляли жалобы на повышенную чувствительность к определенным аллергенам и провоцирующим факторам (физические, химические, эмоциональные факторы, метеофакторы).

Сравниваемые группы пациентов статистически значимо не различались по возрасту, продолжительности заболевания, уровню общего IgE. (р>0,05). На период проводимого исследования частота дневных и ночных симптомов, а также использования ß2 -агонистов короткого действия была достоверно выше в группе пациентов с тяжелой БА (р<0,05). Показатели ФВД – ЖЕЛ,  ФЖЕЛ, ОФВ1, ПОС были значительно ниже у пациентов с тяжелой АБА (р <0,05).

По данным  аллергологического обследования (кожное тестирование, уровень специфического и общего IgE) у всех пациентов была установлена специфическая гиперчувствительность к бытовым аллергенам (домашняя пыль, D.pteronyssinus), при этом в форме моносенсибилизации — у 10 пациентов (50%), сочетанная сенсибилизация к бытовым и пыльцевым аллергенам — у 6 пациентов (30%), к бытовым, эпидермальным, пыльцевым — у 4 (20%).

Отягощенная наследственность по наличию атопических заболеваний наблюдалась более чем у 60% больных 1 и 2 групп, при этом чаще по материнской линии (62,5%  и 66,6 %, соответственно). Дебют БА в обеих группах приходился на младший школьный возраст (6-12 лет). У 85, 2 % пациентов 1 группы и 89,3 % пациентов 2 группы БА сочеталась с аллергическим ринитом, при этом у лиц с тяжелым течением АБА имелась тенденция к более выраженным симптомам ринита.

Представленная клиническая картина демонстрирует необходимость тщательного наблюдения и ведения таких пациентов, более глубокого диагностического подхода в отдельных случаях. Принимая во внимание данные литературы о торможении апоптоза лимфоцитов при астме, возникает потребность в изучении механизмов этого процесса при атопической бронхиальной астме.

Методикой исследования лимфоцитов предусмотрено, что в процессе культивирования клетки оказываются в стрессовых условиях из-за снижения питательных компонентов в среде, вследствие чего запускается процесс апоптоза. В иммунной системе чаще других реализуются три формы апоптоза: гибель клеток вследствие дефицита ростовых факторов, апоптоз, вызванный глюкокортикоидами и другими агентами со сходным действием, и «активационный» апоптоз, развивающийся вследствие дисбаланса активационных сигналов или по другим причинам, обусловливающим включение программы гибели клетки при их активации [1]. В нашем исследовании в качестве стимулирующего агента был использован дексаметазон. Спонтанную активацию апоптоза можно наблюдать в первые дни культивирования, однако она не значительна. А уже на 6 сутки культивирования отмечается значительное увеличение апоптотических клеток. Показано, что в культуре лимфоцитов при патологии, динамика этого процесса нарушена.

С целью характеристики биохимических параметров апоптоза, проводилось сравнение содержания апоптотических клеток на 6 сутки культивирования (рис.1, а). Было установлено, что апоптоз Т-лимфоцитов больных астмой проявляется по-разному в зависимости от степени тяжести заболевания. В группе с легкой формой астмы уровень апоптоза лимфоцитов оказался ниже (4,28±0,16) по сравнению с контрольной группой (10,07±2,05). Количество апоптотических клеток в группе с тяжелой астмой составило12,63±4,98.

Рис. 1. а) Содержание лимфоцитов на поздней стадии апоптоза после 6 дней культивирования; б) Содержание лимфоцитов на поздней стадии апоптоза после 6 дней культивирования с дексаметазоном (10-4М).

 Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой

Результаты экспериментального наблюдения индуцированного апоптоза показало, что дексаметазон действительно оказал стимулирующее действие на лимфоциты в группах контроля и легкой АБА, но не повлиял на клетки тяжелой АБА (рис. 1, б). На ранней стадии апоптоза происходят изменения в плазматической мембране клетки. В апоптотических клетках происходит транслокация мембранного фосфолипида фосфатидилсерина (PS) с внутренней стороны плазматической мембраны на ее внешнюю сторону [7]. В проведенном исследовании было установлено, что на 6 сутки культивирования без дексаметазона (рис. 2,б) в контроле число клеток с ранними проявлениями апоптоза достигает 60%. У больных с легкой формой АБА количество таких лимфоцитов составляет 32%, а у больных с тяжелой АБА – 36%.

При индуцированном апоптозе клетки условно здоровых доноров проявляли устойчивость к действию дексаметазона по сравнению со спонтанным апоптозом (рис.2, б). Культивирование лимфоцитов больных легкой формой АБА с дексаметазоном в течение 6 суток также показало резистентность к развитию апоптоза, в то время как количество апоптотических лимфоцитов у больных тяжелой АБА было выше, чем в других исследуемых группах.

Рис. 2. а) Содержание лимфоцитов на поздней стадии апоптоза после 6 дней культивирования без и с дексаметазоном (Декс) (10-4М); б) Содержание лимфоцитов с ранними признаками апоптоза после 6 дней культивирования без и с дексаметазона (Декс) (10-4М). К – контроль, Л — легкая АБА, Т — тяжелая АБА.

 Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой

Методом электронной микроскопии были получены изображения Т-лимфоцитов до и после культивирования. Свежевыделенные лимфоциты условно здоровых доноров имели правильную округлую форму с большим количеством микроворсинок на клеточной мембране (рис. 3, а).

Рис. 3. Морфология лимфоцитов здоровых доноров. а) До культивирования всем лимфоцитам присуща типичная морфология, без изменений (увеличение х10000); б) После 6 дней культивирования морфология некоторых лимфоцитов претерпевает ряд изменений, соответствующие апоптотическим клеткам (увеличение х5000).

Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой

Ядро с хорошо дифференцированным хроматином, как правило, занимает большую часть клетки, округлой формы, расположено центрально. В цитоплазме имеется большое количество митохондрий, с хорошо различимыми кристами, вакуоли, рибосомы, аппарат Гольджи и эндоплазматический ретикулум. В процессе культивирования морфология лимфоцитов претерпевает ряд изменений, соответствующих апоптотическим клеткам (рис. 3, б). Во-первых, потеря клеточной мембраной микроворсинок (характерный морфологический признак апоптоза). Во-вторых, конденсация хроматина по периферии ядра. В число основных морфологических признаков апоптоза входят вакуолизация и конденсация цитоплазмы с последующей клеточной фрагментацией на апоптические тельца, содержащие остатки ДНК и клеточные органеллы. На микрофотографии (рис. 3, б) представлены: клетка без морфологических изменений, лимфоцит с ранними проявлениями апоптоза (отсутствие микроворсинок, конденсация хроматина, инвагинация ядерной и цитоплазматической мембран) и апоптотическое тельце с вакуолями, митохондриями и гранулами внутри.

Морфология свежевыделенных лимфоцитов в группе с легкой АБА не отличалась от контрольной группы. Они также имели правильную округлую форму с большим количеством микроворсинок (рис. 4, а).

Рис. 4. Морфология лимфоцитов больных легкой формой АБА. а) Лимфоцит до культивирования с нормальной морфологией (увеличение х10000); б) После 6 дней культивирования большая часть клеток сохраняла типичную морфологию (увеличение х8000); в) Апоптотические тельца с различными клеточными органеллами, в том числе аутофагасомами (увеличение х12000).

 Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой

В процессе культивирования большая часть клеток сохраняла типичную морфологию (рис.4, б). На микрофотографиях также были обнаружены апоптотические тельца (рис. 5, в). Нужно отметить, что в отличие от предыдущей группы, содержимое их немного отличалось. Внутри телец присутствовало довольно много так называемых аутофагосом.

Рис. 5. Морфология лимфоцитов больных тяжелой формой АБА. а) До культивирования всем лимфоцитам присуща типичная морфология, без изменений (увеличение х6000); б) Посел 6 дней культивирования отмечается увеличение содержания апоптотических телец (увеличение х10000).

Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой

Большинство лимфоцитов в приготовленных препаратах больных тяжелой АБА имели такую же морфологию, как в предыдущих группах, но отмечено отсутствие микроворсинок на плазматической мембране (рис. 5, а). Остальные клеточные структуры были без изменений. После культивирования большинство клеток подверглось деградации, поэтому значительную часть микрофотографий составляют апоптотические тельца с различным содержимым внутри (аутофагасомы, митохондрии, остатки ядра) (рис. 5, б).

На рисунке 6 приведены изображения Т-лимфоцитов до культивирования, полученные с помощью атомно-силового микроскопа. Как правило, высоту клеток определяют внутриклеточные компоненты (такие как ядро, митохондрии, гранулы и т.д.), поскольку при нанесении лимфоцитов на стекло вся цитоплазма распластывается по стеклу. Исследование показало, что лимфоциты как здоровых доноров (рис.6, a), так и больных легкой и тяжелой АБА (рис. 6, б и с соответственно) имели типичную сферическую форму. Помимо ядра различимы другие компоненты клеток, которые могут соответствовать митохондриям. Все клетки были высокими, имели шероховатую гранулярную поверхность. Размер представленных клеток составляет около 12 мкм в ширину и 1-2 мкм в высоту.

Рис.6. АСМ-изображения лимфоцитов до культивирования. а) Т-лимфоцит здорового донора; б) Т-лимфоцит больного легкой формой АБА; с) Т-лимфоцит больного тяжелой формой АБА

Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой

Атомно-силовая микроскопия позволила визуализировать существенные различия в поверхностной морфологии клеток до и после воздействия дексаметазоном. Обнаружено, что клетки всех трех исследуемых групп после воздействия глюкокортикоидом уменьшаются в размерах (~ 8 мкм) и становятся более плоскими (рис. 7). Высота клеток составляла 0,4–0,7 мкм. На поверхности клеток видны локальные выпячивания наружной мембраны, а также визуализируется формирование апоптических телец.

Рис.7. АСМ-изображения лимфоцитов после культивирования с дексаметазоном. а) Т-лимфоцит здорового донора; б) Т-лимфоцит больного легкой формой АБА; с) Т-лимфоцит больного тяжелой формой АБА

Особенности апоптоза лимфоцитов у больных легкой и тяжелой атопической бронхиальной астмой

Обсуждения

Развитие хронического воспаления при БА в первую очередь зависит от продолжительности рекрутирования клеток из кровеносного русла в слизистую оболочку бронхов и их поверхностной активации. Существует мнение о ведущей роли в персистенции воспалительного процесса механизмов, отвечающих за регуляцию жизнеспособности и гибели клеток [8,9]. Исследование апоптоза в эксперименте in vitro c использованием клеточных культур дает сегодня возможность более глубокого понимания молекулярных нарушений и кинетики этого процесса при развитии атопических заболеваний [10].

Исследование биохимических показателей апоптоза лимфоцитов показало, что этот процесс идет по-разному в зависимости от степени тяжести АБА. Несмотря на снижение апоптотической активности лимфоцитов в группе легкой АБА, в целом, характер биохимических изменений совпадает с группой контроля. Во-первых, установлен индуцирующий эффект дексаметазона на апоптоз лимфоцитов. При этом, полученные результаты совпадают с литературными данными, показывающими стимулирующее влияние глюкокортикоида на апоптоз лимфоцитов при астме. Во-вторых, установлен идентичный характер течения апоптоза в этих группах на ранних этапах. Отмечено значительное содержание апоптотических клеток с ранними проявлениями апоптоза в клеточной культуре без стимуляции. Под влиянием дексаметазона их содержание уменьшалось в обеих группах.

Иной характер изменений отмечен в группе с тяжелой формой АБА. Установлено, что культивирование лимфоцитов приводит к усилению спонтанной апоптотической активности. Дексаметазон оказывал влияние на увеличение содержания лимфоцитов с ранними проявлениями апоптоза и, в то же время, снижал количество клеток с поздними признаками. Можно предположить, что в действительности глюкокортикоид в последнем случае также оказывал стимулирующее действие, но большинство клеток уже перешли на завершающую стадию и превратились в так называемые апоптотические тельца.

Морфологические признаки апоптоза, в том числе образование апоптотических телец, хорошо визуализируются методом электронной микроскопии. В целом, морфология лимфоцитов больных легкой АБА не отличается от морфологии лимфоцитов контрольной группы. Однако, были обнаружены апоптотические тельца, внутри которых присутствовало довольно много аутофагосом. Наличие аутофагосом в клетках и апоптотических тельцах может объяснить относительно невысокое содержание апоптотических клеток в группе легкой АБА.

Лимфоциты больных тяжелой формой АБА до культивирования имели такую же морфологию, как и две другие группы, но отмечено отсутствие микроворсинок на плазматической мембране. Остальные клеточные структуры без изменений. После культивирования большинство клеток подверглось деградации, поэтому значительную часть составляют апоптотические тельца с различным содержимым внутри (аутофагасомы, митохондрии, остатки ядра).

Атомно-силовая микроскопия позволила визуализировать существенные различия в поверхностной морфологии клеток до и после воздействия дексаметазоном. Среди структурно-функциональных систем клетки важную роль играют белки плазматической мембраны, обеспечивающие барьер клетки, ионный транспорт, межклеточную коммуникацию, внутриклеточную передачу информации. Они определяют морфологические и механические свойства клетки. Нарушение любого из этих свойств клетки может приводить к изменению ее жизнедеятельности или даже гибели. В нашем исследовании на поверхности плазматической мембраны были выявлены глобулы, предположительно являющиеся частью мембранных белков. Плазматическая мембрана лимфоцитов обладает ровным, диффузионным, упорядоченным рельефом.

После воздействия дексаметазоном клетки уменьшились в размерах и стали более плоскими. На поверхности клеток видны локальные выпячивания наружной мембраны, а также визуализируется формирование апоптических телец. Клеточная мембрана лимфоцитов образует многочисленные глубокие инвагинации. Топографическое исследование поверхности Т-лимфоцитов показало, что имеется большое количество глобулярных структур, но они большего размера, чем у клеток до стимуляции.

Проведенное морфо-биохимическое исследование апоптотической активности Т-лимфоцитов в различных группах АБА выявило особенности внутри каждой группы. В частности, было установлено, что биохимические и морфологические проявления апоптоза у больных легкой формой астмы отражали нормальное течение спонтанного апоптоза. Однако, при индуцированном апоптозе лимфоциты проявляли резистентность на ранних этапах. В лимфоцитах больных тяжелой АБА отмечен противоположный характер изменений. Культивирование приводило к усилению спонтанной апоптотической активности, в то время как дексаметазон снижал количество клеток с поздними признаками. Биохимические признаки апоптоза согласовывались с его морфологическими проявлениями. Впервые для изучения влияния дексаметазона на лимфоциты был применен метод атомно-силовой микроскопии, показавший изменение в топографии клеток.

Таким образом, установлены характерные морфологические и биохимические особенности течения апоптоза в Т-лимфоцитах больных легкой и тяжелой АБА. В основе деградации клеток может принимать участие не только процесс апоптоза, но и другая форма программированной клеточной гибели — аутофагия. Указанные особенности апоптоза у больных АБА тяжелого течения позволят оптимизировать базисную терапию глюкокортикостероидами у пациентов данной группы.

 

Ю.В. Скибо, Н.Ш. Курмаева    

Казанский Федеральный университет

Казанский государственный медицинский университет 

Скибо Юлия Валерьевна — аспирант кафедры биохимии КФУ

 

Литература:

1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. — Москва: Эдиториал УРСС, 2002. — 320 с.

2. Jäättelä M. Programmed cell death: many ways for cells to die decently // Ann Med. — 2002. — Vol. 34, №6. — P. 480-488.

3. Райхлин Н.Т., Райхлин А.Н. Регуляция и проявления апоптоза в физиологических условиях и в опухолях // Вопросы онкологии. 2002. — №48. — C. 159-171.

4. Vignola A.M., Chiappara G., Gagliardo R. et all. Apoptosis and airway inflammation in asthma // Apoptosis. — 2000. — Vol. 5, № 5. — P. 473-484.

5. Todo-Bom A., Pinto A.M., Alves V. et all. Apoptosis and Asthma in the Elderly // J. Investig Allergol Clin. Immunol. — 2007. — Vol. 17, №2. — P. 107-112.

6. Buc M, Dzurilla M, Bucova M. Immunophathogenesis of bronchial asthma //Arch. Immunol. Ther Exp. — 2009. — Vol. 57. — P. 331-44.

7. Saraste A, Pulkki K. Morphologic and biochemical hallmarks of apoptosis // Cardiovasc Res. — 2000. — Vol. 45, №3. — P. 528-537.

8. Бойчук С.В., Мустафин И.Г., Фассахов Р.С. Механизмы апоптоза лимфоцитов периферической крови больных атопической бронхиальной астмой. // Аллергология. — 2001. — № 1. — С. 3-9.

9. Невзорова В.А., Суровенко Т.Н., Коновалова Е.Н. Апоптоз и воспаление при бронхиальной астме // Терапевтический архив. — 2001. — № 12. — С. 92-96.

10. Мамонтова Т.В., Кайдашев И.П. Новые аспекты апоптоза мононуклеарных клеток в патогенезе атопической бронхиальной астмы // Аллергология. — 2005. — №4. — С.15-23.