В статье приведены результаты исследования функционального состояния лимфоцитарного звена у новорожденных с различной перинатальной патологией. Выявлены особенности содержания гиподиплоидных (апоптотических) и гиперплоидных (пролиферирующих) лимфоцитов в зависимости от перинатальной патологии у новорожденных с различным гестационным возрастом.
Features of the maintenance hypodiploidic and hyperploidic lymphocytes at newborn children of various gestational age with сlinical signs of adaptation failure in the early neonatal period
The article presents results of studying the functional state of a lymphocytic link at newborns with a various perinatal pathology. Features of the maintenance hypodiploidic (apoptotic) and hyperploidic (proliferating) lymphocytes depending on a perinatal pathology at newborns with various gestational age are revealed.
Многие патологические процессы в периоде новорожденности оставляют глубокий след и могут проявиться на любом возрастном этапе всей последующей жизни [1-4]. В неонатальном периоде остается актуальной проблема влияния апоптоза и пролиферации клеток на становление адаптационных процессов у новорожденного ребенка. Известно, что характер адаптационных реакций определяется состоянием нуклеиновых кислот: РНК определяет характер кратковременной адаптации, а ДНК – долгосрочной [5]. С учётом данного положения оценка параметров клеточной (ядерной) ДНК позволяет разработать методы долговременного прогнозирования исходов срыва адаптации у новорожденного ребенка в раннем неонатальном периоде. Работ, посвящённых изучению ядерной ДНК лимфоцитов, крайне мало. Имеются единичные работы, посвященные исследованию ядерной ДНК у новорожденных [6-9], но информация, содержащаяся в них, разноречива в силу различных методических подходов с использованием рутинных (качественных и полуколичественных) методов определения нуклеиновой кислоты.
Цель работы — определить особенности параметров ядерной ДНК в зависимости от клинической картины срыва адаптации в раннем неонатальном периоде у новорожденных различного гестационного возраста.
Материал и методы исследования
Под наблюдением находились 110 новорожденных детей различного гестационного возраста с различной перинатальной патологией. Все новорожденные были разделены на 5 групп. Первую группу составили 12 новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее, вторую группу – 14 новорожденных с гестационным возрастом 32-34 недели, третью группу – 17 новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель, четвертую группу – 51 новорожденный с гестационным возрастом 38-42 недели. Пятую группу (группу сравнения) составили 16 условно здоровых доношенных новорожденных.
Перинатальная патология была представлена следующими заболеваниями: перинатальное поражение центральной нервной системы (в том числе, церебральная ишемия различного генеза и спинальная травма), гнойно-воспалительные заболевания, пневмопатии, конъюгационная гипербилирубинемия (табл. 1).
Таблица 1.
Распределение новорожденных по основному заболеванию
Перинатальная патология | Удельный вес детей в группе, % | ||||
I n=12 | II n=14 | III n=17 | IV n=51 | V n=16 | |
| Перинатальное поражение центральной нервной системы | 16,7±10,8 | 28,6±12,1 | 11,8±7,8 | 37,3±6,8 | 0 |
| Пневмопатии | 16,7±10,8 | 35,7±12,8 | 11,8±7,8 | 9,8±4,2 | 0 |
| Гнойно-воспалительные заболевания | 66,7±13,6 | 35,7±12,8 | 47,1±12,1 | 23,5±5,9 | 0 |
| Конъюгационная гипербилирубинемия | 0 | 0 | 29,4±11,1 | 29,4±6,4 | 0 |
Всем пациентам проводился традиционный комплекс лабораторно-инструментальных исследований, включающий общий анализ крови, биохимический анализ крови (общий билирубин и его фракции), по показаниям нейросонография, ультразвуковое исследование внутренних органов, рентгенография органов грудной клетки и брюшной полости.
В качестве субстрата для исследования использовалась венозная кровь новорожденных детей. Выделялись лимфоциты стандартным методом A.Boyum [10]. Исследование популяций лимфоцитов проводилось с помощью метода проточной цитофлуориметрии с использованием пропидиума йодида — I. Nicoletti [11].
На гистограммах оценивалось процентное содержание гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов. Гиподиплоидные клетки вследствие потери части ДНК в процессе апоптоза [12] находятся в зоне с низкой интенсивностью флуоресценции (фракция слева от основного пика G0, соответствующего диплоидным клеткам). Правее диплоидного пика находится пик G1–G2, содержащий удвоенное количество ДНК, т.е. тетраплоидные клетки, которые в определенной степени характеризуют активность пролиферативного процесса. На рисунке 1 приведен пример одной из типичных гистограмм.
Рисунок 1. Двухмерная гистограмма распределения лимфоцитов периферической крови по интенсивности флуоресценции
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью табличного редактора Microsoft Excel 2003, Statistica 6.0. Данные, подчиняющиеся закону нормального распределения, представляли в виде среднего значения и стандартного отклонения. Уровень статистической значимости (р) считался меньше 0,05.
Результаты исследования
Установлена нелинейная зависимость количества определенной популяции лимфоцитов от гестационного возраста (рис. 2, табл. 2).
Рисунок 2. Процентное содержание гиподиплоидных (темные столбики) и гиперплоидных (светлые столбики) лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста (по оси Х – группы новорожденных, по оси Y – содержание лимфоцитов, %)
Таблица 2.
Сравнение абсолютного содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных различного гестационного возраста
Изучаемый параметр | I n=12 | II n=14 | III n=17 | IV n=51 | V n=16 | Р |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Гиподиплоидные клетки, абс. кол-во клеток в 1 нл | 64,0±12,8 | 128,7±22,6 | 259,0±47,1 | 138,4±22,1 | 57,8±11,2 | P3-6<0,05 Р4-5<0,05 Р4-6<0,01 P5-6<0,01 |
| Гиперплоид-ные клетки, абс. кол-во клеток в 1 нл | 89,2±19,0 | 42,3±14,6 | 22,2±4,0 | 34,4±5,0 | 57,9±19,2 | Р2-4<0,01 Р2-5<0,05 |
В группе сравнения содержание гиподиплоидных лимфоцитов составило 2,1±0,4% (57,8±11,2 клеток/нл), гиперплоидных лимфоцитов — 1,7±0,5% (57,9±19,2 клеток/нл). Во II, III и IV группах новорожденных, по сравнению со средними показателями содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов у детей группы сравнения, отмечается достоверное повышение среднего процентного и абсолютного количества гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови.
Максимальное количество лимфоцитов с гиподиплоидным содержанием ядерной ДНК наблюдалось у новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель – 9,1±0,8% (259,0±47,1 клеток/нл; р<0,01). У доношенных новорожденных с лабораторно-клиническими признаками осложнений периода адаптации апоптотических лимфоцитов в 2,5 раза больше по сравнению с условно здоровыми новорожденными (р<0,01).
Максимальное количество гиперплоидных лимфоцитов наблюдалось у новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее, что, возможно, указывает на интенсивное течение процессов деления, пролиферации лимфоцитов. У новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель, наоборот, зафиксировано минимальное процентное и абсолютное содержание лимфоцитов с повышенным количеством ядерной ДНК (р<0,01).
Выявленная нелинейная зависимость содержания гиподиплоидных и гиперплоидных лимфоцитов от сроков гестации может служить отражением изменений интенсивности процессов апоптоза и пролиферации в различные периоды внутриутробного созревания плода: активность апоптоза постепенно нарастает с 28 недель гестации, достигая максимальных значений в период 35-37 недель, после чего, к моменту рождения, постепенно снижается, а интенсивность процессов пролиферации с максимумом в период 31 неделя и менее снижается к 35-37 неделям гестации и нарастает к моменту рождения.
Нами выведен сводный коэффициент отношения абсолютного содержания гиперплоидных лимфоцитов к абсолютному содержанию гиподиплоидных лимфоцитов (k). Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Коэффициент отношения абсолютного количества гиперплоидных лимфоцитов к абсолютному количеству гиподиплоидных лимфоцитов (k) в исследуемых группах новорожденных детей
I n=12 | II n=14 | III n=17 | IV n=51 | V n=16 | Р |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
2,2±0,6 | 1,3±0,8 | 0,2±0,1 | 0,3±0,1 | 1,0±0,4 | Р1-3<0,01 Р1-4<0,01 |
Как видно из таблицы, в группе условно здоровых доношенных новорожденных коэффициент k равен единице: количество апоптотических и пролиферирующих лимфоцитов должно быть одинаковым (соответственно, 57,8±11,2 и 57,9±19,2 клеток/нл в раннем неонатальном периоде). Максимальное значение коэффициента (2,2±0,6) зафиксировано у недоношенных новорожденных со сроком гестации 31 неделя и менее, минимальное значение у детей со сроком гестации 35-37 недель (0,2±0,1).
Рисунок 3. Процентное количество гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основного заболевания (по оси Х– исследуемые группы новорожденных, по оси Y–количество гиподиплоидных лимфоцитов,%)
Из данных, представленных в таблице 4 и на рисунке 3, видно, что наиболее интенсивно процессы апоптоза протекают при наличии конъюгационной гипербилирубинемии у доношенных новорожденных и новорожденных со сроком гестации 35-37 недель. При этом варианте осложнения периода адаптации наблюдается достоверно наибольшее количество гиподиплоидных лимфоцитов (максимум зафиксирован у детей со сроком гестации 35-37 недель – 11,8±1,5%, или 424,2±113,8 клеток/нл; р<0,01).
Таблица 4.
Абсолютное содержание гиподиплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основного заболевания
Изучаемый параметр | I n=12 | II n=14 | III n=17 | IV n=51 | V n=16 | Р |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Перинатальные поражения ЦНС, клеток/нл | 98,9±61,6 | 109,4±32,9 | 132,0±6,6 | 138,9±32,9 | 57,8±11,2 | Р4-6<0,01 P5-6<0,05 |
| Пневмопатии, клеток/нл | 95,5±4,2 | 164,9±28,6 | 81,1±62,9 | 30,2±10,2 | 57,8±11,2 | Р2-6<0,01 P3-6<0,01 |
| Гнойно-воспалительные заболевания, клеток/нл | 47,4±11,5 | 107,8±51,6 | 231,9±42,1 | 110,9±39,4 | 57,8±11,2 | P4-6<0,01 |
| Конъюгационная гипербилирубин-емия, клеток/нл | — | — | 424,2±113,8 | 192,5±47,1 | 57,8±11,2 | P4-6<0,01 P5-6<0,05 |
Наименьшее содержание гиподиплоидных лимфоцитов было зафиксировано при пневмопатиях у доношенных новорожденных (1,3±0,4%, или 30,2±10,2 клеток/нл; р<0,01) и при гнойно-воспалительных заболеваниях у детей со сроком гестации 31 неделя и менее (1,3±0,3%, или 47,4±11,5 клеток/нл; р<0,01). При наличии пневмопатий или гнойно-воспалительных заболеваний процентное содержание лимфоцитов с гиподиплоидным набором ядерной ДНК достоверно повышается с увеличением гестационного возраста, достигая максимального уровня в 35-37 недель, а потом, ближе к моменту рождения, резко снижается. При перинатальном поражении центральной нервной системы количество гиподиплоидных лимфоцитов достигает максимального уровня уже в 32-34 недели гестации (8,1±2,3%, р<0,05), а потом постепенно снижается.
Абсолютное количество апоптотических лимфоцитов в группе доношенных новорожденных с перинатальным поражением ЦНС (138,9±32,9 клеток/нл) достоверно (р<0,05) выше, чем у здоровых новорожденных (57,8±11,2 клеток/нл). При пневмопатиях этот параметр имеет достоверно (р<0,01) максимальное значение (164,9±28,6 клеток/нл) у новорожденных со сроком гестации 32-34 недели.
При гнойно-воспалительных заболеваниях самое большое абсолютное количество апоптотических лимфоцитов зафиксировано у детей с гестационным возрастом 35-37 недель (231,9±42,1 клеток/нл; р<0,01).
У всех недоношенных новорожденных (I, II, III группы) при любом осложнении течения периода адаптации процентное количество гиперплоидных лимфоцитов возрастает по сравнению с количеством этих клеток у условно здоровых доношенных новорожденных (рис. 4).
Рисунок 4. Процентное количество гиперплоидных лимфоцитов в периферической крови новорожденных в зависимости от гестационного возраста и основной перинатальной патологии (по оси Х – исследуемые группы, по оси Y – количество гиперплоидных лимфоцитов, %)
В I и II группах новорожденных уровень гиперплоидных лимфоцитов резко повышен у детей с гнойно-воспалительными заболеваниями (максимальный уровень зафиксирован у новорожденных со сроком гестации 32-34 недели – 18,3±1,8%; р<0,01). У детей со сроком гестации 35-37 недель самое большое содержание пролиферирующих лимфоцитов отмечалось у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы (5,8±0,8%, р<0,05).
Выводы
1. В группе условно здоровых новорожденных детей установлены нормативы содержания гиподиплоидных лимфоцитов – 2,1±0,4%, или 57,8±11,2 клеток/нл, гиперплоидных лимфоцитов – 1,7±0,5%, или 57,9±19,2 клеток/нл.
2. У новорожденных с гестационным возрастом 31 неделя и менее преобладают гиперплоидные лимфоциты (2,3±0,4%, или 89,2±19,0 кл/нл). С увеличением гестационного возраста уровень гиперплоидных лимфоцитов снижается, достигая минимальных значений к 35-37 неделям гестации (1,2±0,3%, или 22,2±4,0 кл/нл), а содержание гиподиплоидных лимфоцитов к 35-37 неделям гестации возрастает до максимума (9,0±0,8%, или 259,0±47,1 кл/нл).
3. При наличии клинико-лабораторных признаков осложнений периода адаптации в раннем неонатальном периоде наблюдается однонаправленная динамика изменения уровня гиподиплоидных лимфоцитов в сторону увеличения независимо от вида перинатальной патологии.
4. Максимальные значения гиперплоидных лимфоцитов у новорожденных с гестационным возрастом менее 35 недель и у доношенных новорожденных отмечаются при гнойно-воспалительных заболеваниях; в группе новорожденных с гестационным возрастом 35-37 недель – при перинатальном поражении ЦНС.
Д.И. Шегурова, В.В. Софронов, И.Г. Мустафин, С.А. Любин
Казанский государственный медицинский университет
Городская детская больница №1, г. Казань
Шегурова Диана Ильдаровна — врач отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных
Литература:
1. Володин Н.Н. Неонатология. Национальное руководство / Под ред. Н.Н.Володина // М.: ГЭОТАР-Медиа. — 2008. — 749 с.
2. Чистякова Г.Н. Иммунологические особенности периода ранней постнатальной адаптации новорожденных от женщин с патологически протекающей беременностью // Мать и дитя в Кузбассе. — 2005. — № 3 (22). — С. 17-22.
3. Аронскинд Е.В., Уфимцева Л.А., Курова Э.Г. и др. Состояние здоровья детей, перенесших критические состояния в периоде новорожденности // Педиатрия: Журнал им. Г. Н. Сперанского. — 2004. — № 1 . — С. 39-42.
4. McCormick, Marie C., Jeanne Brooks-Gunn et. al. The health and developmental of very low-birth-weight children at school age // JAMA. — 1992. — Vol. 267. — P. 2204-2208.
5. Саркисов Д.С. Очерки истории общей патологии. — М.: Медицина. — 1993. — 486 с.
6. Талаев В.Ю., Лебедева И.Е., Мазепа В.Н., Талаева Е.Б. Индуцированный активацией апоптоз лимфоцитов крови новорожденных. Зависимость характера ответа от клинического состояния новорожденных // Иммунология. — 1997. — № 1. — С. 47-50.
7. Талаев В.Ю. Повышенная чувствительность Т-лимфоцитов новорожденных к активационному апоптозу // Педиатрия. — 2000. — № 3. — С. 8-11.
8. Софронов В.В., Туаева Н.О., Винтер В.Г. и др. Изменение содержания ядерной и внеклеточной ДНК у новорождённых с клиническими проявлениями нарушения адаптации в раннем неонатальном периоде // Вопросы современной педиатрии. — 2006. — Т. 5. — № 6. — С. 28-31.
9. Громада Н.Е. Цитокиновый профиль и количественное значение ДНК в ядрах лимфоцитов периферической крови у новорожденных с гипоксическим перинатальным поражением центральной нервной системы // Цитокины и воспаление. — 2008. — Т. 7, № 3. — С. 14-18.
10. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow // Scand. J. Clin. Lab. Investig. — 1968. — Vol. 21. — № 97. — P. 1-9.
11. Nicoletti I., Migliorati G., Pagliacci M.C. et. al. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry // J. Immunol Methods. — 1991. — Vol. 139. — P. 271-280.
12. Mac Closkey T. W., Oyaizi N., Coronezi M., Pahwa S. Use of flow cytometric assay to quantitate apoptosis in human lymphocytes // Clin. Immunol. Immunopathol. — 2004. — Vol. 71. — P. 14-18.
