Разработана отечественная тест-система «Лайн-Блот Сифилис» (ЗАО «ЭКОлаб») на основе метода линейного иммуноблоттинга с использованием рекомбинантных антигенов Treponema Pallidum. Рекомендовано использовать тест-систему «Лайн-Блот Сифилис» (ЗАО «ЭКОлаб») в качестве подтверждающего теста на сифилис.
Patriotic test-system «Line Blot Syphilis» for the diagnosis of syphilis by the linear immunoblotting
It is developed domestic test-system «Line Blot Syphilis» (JSC «Ecolab») based on the method of linear immunoblotting using recombinant antigens Treponema Pallidum. Encouraged to use the test system «Line-Blot Syphilis» (JSC «Ecolab») as confirming test for syphilis.
Введение
Сифилис — инфекционное заболевание человека, лабораторная диагностика которого требует проведения микробиологических и серологических исследований [1]. Несмотря на значимость прямых методов обнаружения Т.pallidum, серологические реакции являются в настоящее время основным инструментом диагностики сифилиса. Серологическая диагностика сифилиса, исключая скрининговые обследования, носит комплексный характер. Применение двух методов: нетрепонемного и трепонемного — позволяет увеличить вероятность постановки правильного диагноза [1, 2].
В силу ряда объективных и субъективных причин специфические тесты на сифилис не всегда дают однозначные результаты. На этом фоне достоверность диагноза зависит от количества проведенных исследований, что в свою очередь делает всю диагностическую процедуру трудоемкой и дорогостоящей. В связи с этим разработка новых чувствительных и специфичных диагностических наборов с целью минимизировать объем необходимых серологических исследований является актуальной проблемой сифилидологии [3, 4].
В последние годы за рубежом для серодиагностики сифилиса начали активно использовать метод иммуноблоттинга. В настоящее время в России зарегистрированы две коммерческие тест-системы, выполнены в формате линейного блота, INNO-LIA Syphilis Score (Innogenetics, Бельгия) и «Лайн-Блот Cифилис» (ЗАО «ЭКОлаб», Россия). Дизайн диагностикумов «Лайн-Блот Сифилис» и INNO-LIA Syphilis Score основан на принципах общих для тест-систем подтверждающего формата — на одновременном выявлении серологических маркеров инфекции к отдельным антигенам Т.pallidum.
Диагностическая тест-система «Лайн-Блот Cифилис»
Дизайн тест-системы
Диагностическая тест-система «Лайн-Блот Cифилис» производства ЗАО «ЭКОлаб» (ТУ 9398-118-70423725-2009; Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/06925 от 01 марта 2010 г.) представляет собой набор реагентов, рассчитанный на проведение 24 анализов, позволяющих полуколичественно оценивать в ликворе, плазме и сыворотке крови человека титр антител IgG против четырех антигенов T.pallidum., TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.
В состав набора входят: 10-кратный концентрат промывочного раствора (ПР), раствор для разведения исследуемых образцов (РРО), раствор для разведения конъюгата, конъюгат — антитела козьи к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой, раствор хромогенного субстрата для выявления ферментативной активности щелочной фосфотазы, контрольные образцы (К+ и К-) — сыворотки крови человека, содержащие и не содержащие антитела к T.Pallidum, и тест-полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на которые в виде дискретных линий нанесены четыре рекомбинантных белка TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA.
Кроме линий (зон) рекомбинантных антигенов, на каждом стрипе имеются четыре контрольные линии. Линия контроля антигена (Каг) — для оценки корректности проведения теста на данном исследуемом образце (при правильном проведенном исследовании эта полоса не окрашивается). Три калибровочные линии, которые при проведении анализа дают зоны дискретно уменьшающейся интенсивности окрашивания соответствующие баллам 3+, 1+, 0,5+ (рис. 1).
Рис. 1. Схема нанесения антигенов T.pallidum, контролей и калибраторов на нитроцеллюлозном стрипе в наборе реагентов «Лайн-Блот Сифилис»
Проведение исследования
Процедура анализа исследуемых образцов (сывороток, плазмы и ликворов) с использованием тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» проводится при комнатной температуре (20-25оС). Стрип погружают в 1 мл РРО, содержащий 20 мкл исследуемого образца (разведение 1:50), инкубируют в течение 2 часов. После четырех 5-минутных промывок стрипов 1-кратным ПР к ним добавляют конъюгат (в рабочем разведении), инкубируют в течение 30 мин. Снова выполняют процедуру промывки, как описано выше, добавляют раствор хромогенного субстрата, инкубируют в течение 15 мин. Развитие окраски останавливают посредством 3-кратной промывки стрипов дистиллированной водой. Визуально оценивают полученные результаты путем сравнения интенсивности окрашивания зон нанесения антигенов TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA с окрашиванием трех калибровочных линий (рис. 1).
Регистрация и интерпретация и результатов
Регистрацию результатов проводят визуально, оценивая интенсивность окраски антигенных линий в баллах, посредством сравнения интенсивности окраски антигенных линий с интенсивностью окраски контрольных линий согласно таблице 1.
Таблица 1.
| Интенсивность окрашивания антигенных линий | Оценка в баллах |
| Окрашивание отсутствует или менее интенсивно, чем «0,5+» | 0 |
| Интенсивность окрашивания равна «0,5+» | 0,5 |
| Интенсивность окрашивания выше, чем «0,5+», но ниже или равна «1+» | 1 |
| Интенсивность окрашивания выше, чем «1+», но ниже, чем «3+» | 2 |
| Интенсивность окрашивания равна «3+» | 3 |
| Интенсивность окрашивания выше, чем «3+» | 4 |
По интенсивности и количеству полос, проявившихся на стрипе, интерпретируют результат исследования анализируемого образца сыворотки или спинномозговой жидкости согласно таблице 2.
Таблица 2.
| Наличие и интенсивность антигенных полос на стрипе | Результат исследования |
| Нет окрашенных полос или есть только одна полоса с интенсивностью окрашивания, равной «0,5+» | Отрицательный |
| Есть только одна полоса с интенсивностью окрашивания, не меньшей «1+» | Неопределенный |
| Есть не меньше двух полос с интенсивностью окрашивания, не меньшей «0,5+» | Положительный |
Диагностическая эффективность тест-системы «Лайн-Блот Cифилис»
Оценку чувствительности и специфичности тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» изучалась на коллекции аттестованных образцов сывороток крови, входящих в состав панелей контрольных материалов для серодиагностики сифилиса:
A. — Контрольная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к Тreponema Pallidum; ЗАО «Вектор-Бест»; 8 сывороток; кат. № 1840
B. — П-АТ-Т.Pallidum; Панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к Тreponema рallidum; МБС; 24 инактивированных лиофилизированных сыворотки; Кат. № А-091
C. — Панель сывороток с нормированным содержанием IgG антител к антигенам р17 и р41 (TmpA) Тreponema Pallidum; 18 сывороток
D. — «СОП-антипаллидум» — Стандартный образец предприятия — стандартизованная панель сывороток крови человека, содержащих и не содержащих антитела к Тreponema Pallidum «Эколаб»
E. — Внутрилабораторный контроль антипаллидум; ЗАО «Вектор-Бест»; 24 лиофилизированных сыворотки D-1838
F. — ВЛ-Контроль-АТ- Т.Рallidum; МБС; Контрольная сыворотка, содержащая антитела к Тreponema Pallidum для проведения внутрилабораторного контроля; Кат. № А-092
При проведении этого этапа исследования с использованием коллекции аттестованных образцов сывороток крови, содержащих (n=64) и не содержащих (n=34) антитела к Т.pallidum, была установлена 100%-ная чувствительность и специфичность тест-системы «Лайн-Блот Cифилис». Данные испытания контрольных материалов из состава набора реагентов «П-АТ-Т.pallidum» и побалльная оценка результатов исследования позитивных образцов набора представлены на рисунке 2 и в таблице 3, соответственно.
Рис. 2. Фактические данные исследования сывороток крови из набора реагентов «П-АТ-Т.pallidum», содержащих (№ 1-16) и не содержащих (№ 17-24) антитела к Т.pallidum. Нумерация стрипов соответствует нумерации образцов, входящих в набор «П-АТ-Т.pallidum».
Таблица 3.
Оценка иммунореактивности контрольных сывороток № 1-16 набора «П-АТ-Т.pallidum», выраженная в баллах, по отношению к четырем рекомбинантным антигенам (TpN15, TpN17, TpN47 и TmpA)
| антиген | № образца
| |||||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 | |
| TpN15 | 0 | 0,5 | 0 | 1 | 1 | 2 | 3 | 1 | 0,5 | 1 | 1 | 0,5 | 1 | 2 | 0,5 | 0,5 |
| TpN17 | 2 | 3 | 2 | 4 | 3 | 4 | 4 | 2 | 2 | 4 | 2 | 3 | 2 | 4 | 3 | 3 |
| TmpA | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1 | 0,5 | 2 | 3 | 1 | 0 | 1 | 0,5 | 1 | 1 | 2 | 0 | 0 |
| TpN47 | 1 | 0 | 0 | 2 | 2 | 2 | 3 | 3 | 2 | 2 | 2 | 1 | 2 | 3 | 1 | 1 |
Помимо контрольных панелей сывороток диагностическая значимость тест-системы «Лайн-Блот Cифилис» оценивалась на 162 образцах сывороток крови и 48 образцах спинномозговой жидкости, полученных от пациентов, проходивших обследование на наличие сифилиса в Городской клинической больнице № 14 имени В.Г. Короленко ДЗ г. Москвы. В результате проведенного исследования соответствие данных, полученных в тест-системе «Лайн-Блот Cифилис», с данными «INNO-LIA Syphilis score» составило 100%, с ИФА — 99,5%, а с РИФабс — 96% .
Обсуждение результатов
Разработка технологий производства рекомбинантных антигенов бледной трепонемы способствовало широкому внедрению в серологическую диагностику сифилиса методов иммуноферментного анализа [5-8].
Диагностикум «Лайн-Блот Сифилис» разрабатывался в формате диагностикума, подтверждающего результаты таких высокочувствительных и высокопроизводительных тестов, как ИФА и РПГА. Совокупность антигенных структур, используемых в этих тест-системах, в виде нескольких рекомбинантных белков или всего пула поверхностных белков, выделенных из Т.pallidum, с одной стороны, увеличивает их чувствительность, с другой, негативно отражается на их специфичности. Дизайн диагностикума «Лайн-Блот Сифилис» основан на принципах общего для тест-систем подтверждающего формата — на одновременном выявлении серологических маркеров инфекции к отдельным антигенам.
Тест-система «Лайн-Блот Сифилис» предназначена для выявления и полуколичественной оценки в ликворе, плазме и сыворотке крови человека уровня антител IgG против четырех антигенов T.pallidum., TpN15, TpN17, TpN47 и ТmрА. Для сведения к минимуму возможности субъективной ошибки инкубационные растворы, входящие в тест-систему, имеют индикаторную окраску. Практическое применение тест-системы «Лайн-Блот Сифилис» не требует высокой профессиональной подготовки персонала и дорогостоящего оборудования. Кроме того, несложная и непродолжительная (4 часа) процедура анализа в формате тест-системы «Лайн-Блот Сифилис» делают ее удобным инструментом для исследования большого количества образцов в течение одного рабочего дня.
C.Г. Марданлы, В.А. Арсеньева, М.В. Захаров
ЗАО «ЭКОлаб», г. Электрогорск
Марданлы Сейфаддин Гашимович — к.м.н., президент ЗАО «ЭКОлаб»
Литература:
1. Larsen S.A., Steiner B.M., Rudolph A.H. Laboratory diagnosis and interpretation of tests for syphilis. Clin. Microbiol. Rev. 1995; 8: 1-21.
2. Morse S.A. Advances in diagnostic tests for bacterial STDs. Salud Publica Mex 2003; 45 Suppl 5: S698-S708.
3. Кубанова А.А., Говорун В.М., Китаева Н.В., Фриго Н.В., Кубанов А.А., Ротанов С.В. Достижения и перспективы изучения Treponema pallidum. Вестник дерматологии и венерологии, 2006; 5: 34-37.
4. Фриго Н.В., Ротонов С.В., Нестеренко В.Г., Ловенецкий А.Н., Дударева Л.А. Результаты изучения диагностической эффективности новой тест-системы линейного иммуноферментного анализа «Inno-Lia™ Syphilis Score». 2006; Клиническая лабораторная диагностика. 3: 36-41.
5. Sambri V., Marangoni A., Eyer C., Reichhuber C., Soutschek E., Negosanti M., D’Antuono A., Cevenini R. Western Immunoblotting with Five Treponema pallidum Recombinant Antigens
6. Schmidt B.L., Edjlalipour M., Luger A. Comparative evaluation of nine different enzyme-linked immunosorbent assays for determination of antibodies against Treponema pallidum in patients with primary syphilis. 2000; J Clin Microbiol. 38: 1279-82.
7. Zrein M., Maure I., Boursier F., Soufflet L. Recombinant antigen-based enzyme immunoassay for screening of Treponema pallidum antibodies in blood bank routine. 1995; J Clin Microbiol. 33:525-7.
8. Young H., Moyes A., Seagar L, McMillan A. Novel recombinant-antigen enzyme immunoassay for serological diagnosis of syphilis. 1998; J Clin Microbiol. 36:913-7
