Патогенетические закономерности поражения центральных отделов глазного дна на фоне периферического увеита


В эксперименте in vivo установлено, что интравитреальное введение мононуклеаров крови индуцирует развитие витреоретинальной пролиферации. При этом функционально активные мононуклеары крови индуцируют выраженную фиброваскулярную пролиферативную реакцию в полости глазного яблока. Инактивированные мононуклеары вызывают повреждение внутренних слоев сетчатки с образованием эпиретинальной пролиферативной мембраны. При культивировании мононуклеаров крови в условиях направленного движения питательной среды, сходных с движением жидкости в полости глазного яблока, отмечено повышение внутриклеточной ферментативной активности и ускорение процесса дифференцировки моноцитов в макрофаги, а молодых мезенхимальных клеток — в зрелые формы.

Pathogenic patterns of lesions of the central parts of the ocular fundus in a background of peripheral uveitis

In experiment in vivo it is established that intravitreal introduction mononuclear blood cells induces development of a vitreoretinal proliferation. Thus functionally active mononuclear cells induce the expressed fibrovascular proliferative reaction in an eyeball cavity. Inactivated mononuclear cells cause damage of inside layers of a retina with formation of an epiretinal proliferative membrane. During cultivation mononuclear blood cells in the conditions of the directed flow of the nutrient medium, similar to liquid movement in an eyeball cavity, increase of endocellular fermentative activity and enhancement of differentiation process of monocytes to macrophage, as well as young mesenchynmal cells — in mature forms.

Одним из наиболее тяжелых осложнений периферического увеита, представляющего собой хронический воспалительный процесс на крайней периферии глазного дна, является развитие вторичной макулодистрофии. Тяжесть поражения центральных отделов сетчатки может быть различной: от перераспределения пигмента и появления друзоподобных отложений до экссудативно-геморрагической отслойки пигментного эпителия и нейроэпителия с последующим развитием субретинальной фиброваскулярной мембраны [1]. К настоящему времени подробно описаны клинические формы вторичной макулодистрофии, однако патогенез данного осложнения является предметом дискуссий отечественных и зарубежных исследователей.

Как известно, инициацию и саморазвитие хронического воспалительного процесса детерминируют клетки мононуклеарного ряда, создающие в зоне повреждения микросреду со сложной системой межклеточных контактов [2]. Попадая в определенное микроокружение, мононуклеары адаптируются к среде их будущего обитания благодаря свойству функциональной полипотентности, т.е. способности реализовывать разные потенции генома в зависимости от регуляторных воздействий микроокружения. В полости глазного яблока микроокружение складывается из взаимодействующего комплекса анатомо-физиологических особенностей и внестромальных компонентов регуляции. Анатомо-физиологические особенности определяются наличием направленного движения внутриглазной жидкости и фибриллярным строением стекловидного тела [3, 4]. Внестромальные компоненты представлены как клеточными элементами, мигрирующими в витреальную полость (моноциты/макрофаги, лимфоциты, клетки пигментного эпителия сетчатки, глия и т.д.), так и гуморальными факторами (цитокины, факторы роста).

Цель исследования — в эксперименте изучить влияние факторов микроокружения на морфофункциональный статус мононуклеаров крови.


Материалы и методы  На 1-м этапе исследований изучали динамику развития воспалительно-репаративной реакции в заднем полюсе глаза в зависимости от морфофункционального состояния мононуклеаров крови. Выполнена серия экспериментов на 50 половозрелых крысах-самцах породы Wistar с первоначальной массой 200-250 г. У животных 1-й группы (n=25) патологический процесс моделировали путем интравитреального введения функционально активных мононуклеаров крови. Под эфирным наркозом каждому животному через плоскую часть цилиарного тела в один глаз вводили 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия, содержащего мононуклеары из расчета 3,0×106/мм3, во второй глаз для контроля вводили 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия. Мононуклеары, взятые из крови экспериментального животного, выделяли с помощью градиента фиколл-верографин. Чистота мононуклеаров составила 96-98%, жизнеспособность — 97-98%.

У животных 2-й группы (n=25) патологический процесс индуцировали интравитеальным введением мононуклеаров крови, культивированных в течение 24 часов в условиях гипотермии при температуре 0-1°С и представляющих собой источник естественного комплекса биологически активных веществ. После выдерживания взвеси мононуклеаров в условиях гипотермии жизнеспособность составляла 49%.

В ходе экспериментов проводилась непрямая бинокулярная офтальмоскопия на 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки после инъекции. После каждой офтальмоскопии, за исключением первых суток, под эфирным наркозом декапитировали по 5 животных из экспериментальных групп, выполнялась энуклеация обоих глаз. Полученный материал фиксировался для световой и электронной микроскопии.

На 2-м этапе исследований в эксперименте in vitro изучали влияние направленного движения жидкости на морфофункциональный статус мононуклеаров крови. Разработано устройство — биореактор in vitro, позволяющее моделировать движение питательной среды, сходное с движением жидкости в полости глазного яблока. Устройство представляет собой замкнутую систему с камерой, содержащей полупроницаемый фильтр. Система предварительно заполнялась питательной средой, содержащей 80% cреды McCoy 5A, 20% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицин (из расчета 0,02 мл на 10,0 мл среды). Мононуклеары из крови здоровых доноров-добровольцев выделяли методом фракционирования в градиенте плотности на разделяющем растворе фиколл-верографин. Полученные клетки доводили питательной средой до конечной концентрации 3×106 нуклеаров/мл. Клеточный материал вводили в камеру и помещали на фильтр. Благодаря работе роликового насоса в системе создавалось равномерное направленное движение питательной среды со скоростью 2,1-2,4 мм3/мин. Первичную клеточную культуру инкубировали при постоянном движении жидкой питательной среды с соблюдением условий культивирования.


В качестве контроля изучаемые клетки культивировали на полупроницаемом фильтре, помещенном в чашку Петри с необходимой питательной средой, при строгом соблюдении температурного режима (37°С), содержания СО2 (5-7%) и уровня влажности (100%).

Длительность культивирования составила 24, 48 и 72 часа. По окончании экспериментов клеточный материал исследовали с помощью цитохимических и гистологических методов.

Результаты экспериментов in vivo

В ходе морфологических исследований выявлены следующие изменения. На 3-и сутки после интравитреальной инъекции у животных обеих групп в стекловидном теле обнаруживались клетки мононуклеарного ряда. У животных 2-й группы большинство мононуклеаров было подвержено дистрофическим изменениям в виде пикноза ядра и вакуолизации цитоплазмы. У животных 1-й группы в стекловидном теле среди мононуклеаров выявлялись клетки веретенообразной формы, с овальным или продолговатым ядром и умеренной пиронинофильной цитоплазмой. В слое нервных волокон у животных обеих групп наблюдалась умеренная клеточная инфильтрация. Сетчатка сохраняла связь с хориоидеей, отслойки не обнаружено.

На 7-е сутки — у животных 1-й группы в стекловидном теле выявлялись клетки отростчатой и веретенообразной формы, с базофильной и пиронинофильной цитоплазмой, то есть имела типичное строение для фибробласта. Формировались витреоретинальные шварты. Нарастали дегенеративные изменения в стекловидном теле. По краю сетчатки были выявлены новообразованные сосуды. Наблюдалось истончение наружного ядерного слоя. У животных 2-й группы преретинально, на отдельных участках выявлялись скопления моноцитарно-макрофагальных клеток, местами оседающих на внутренней поверхности сетчатки. В самой ретинальной ткани обнаруживались локальные, различные по площади зоны деструкции внутренней пограничной мембраны.

На 14-е сутки — у животных 1-й группы формировались витреоретинальные шварты, местами с локальной тракционной отслойкой сетчатки. Из клеточных элементов в швартах преобладали зрелые фибробласты. Имело место истончение наружного ядерного слоя, местами с его выпадением. Наблюдалась выраженная клеточная пролиферация по ходу артерий и вен сетчатки и явления ретинальной неоваскуляризации. У животных 2-й группы эпиретинально, соответственно зонам деструкции внутренней пограничной мембраны сетчатки, начинался процесс формирования соединительнотканных волокон. Клеточные элементы были представлены, преимущественно, фибробластами и мононуклеарами. Обнаруживались деструктивные изменения в сетчатке в виде истончения внутреннего ядерного слоя. Нарастали дегенеративные изменения в стекловидном теле.

На 21-е сутки — у животных 1-й группы в стекловидном теле выявлялись грубые фиброваскулярные шварты с тракционной отслойкой сетчатки, кровоизлияния в стекловидное тело и сетчатку. У животных 2-й группы в результате слияния отдельных эпиретинальных мембран сформировалась довольно мощная преретинальная мембрана. Из клеточных элементов в ней преобладали зрелые фибробласты с типичным строением ядра и цитоплазмы. Прогрессировали деструктивные изменения в сетчатке в виде истончения и выпадения внутреннего ядерного слоя. Выявлялись новообразованные сосуды по внутреннему краю сетчатки, со скоплением мононуклеаров паравазально.

Сравнительный анализ результатов морфологических исследований позволил выявить следующие отличия. Интравитреальное введение мононуклеаров крови вызывало у животных обеих групп прогрессирующую деструкцию нейросенсорных клеток. Однако в 1-й группе эти изменения обнаруживались уже на 3-и сутки от начала эксперимента, во 2-й группе — на 7-е сутки (табл. 1).

                        Таблица 1.

Динамика содержания (%) деструктивно измененных нейросенсорных клеток (кариопикноза) сетчатки в 1 мм² среза у животных экспериментальных групп (M±m) 

Группа животных

Сроки эксперимента, сутки

0

3

7

14

21

Функциона

льно активные мононуклеары

2,0+0,02

n=25

2,13+0,02

n=25

3,11+0,02

n=25

9,12+0,04*

n=25

15,32+0,05*

n=25

Культивиро

ванные мононуклеары

2,1+0,03

n=25

2,07+0,03

n=25

2,24+0,04

n=25

5,67+0,06*

n=25

9,39+0,04*

n=25

Примечание: статистически значимые различия отмечены * (р<0,01) при сравнении с фоном (день 0), n — количество срезов сетчаток глаз, энуклеированных у подопытных животных

 

У животных 1-й группы деструктивные изменения через внутренние слои доходили до наружного ядерного слоя и начинались уже с 7-х суток, усиливались к 14-м и местами сопровождались его выпадением. У животных 2-й группы истончение коснулось внутреннего ядерного слоя, которое началось на 14-е сутки. При этом на 21-е сутки выявлено его полное выпадение.

По мере распространения и организации соединительнотканного компонента происходило формирование витреоретинальных шварт. Этот процесс сопровождался неоваскуляризацией различной степени выраженности. При этом у животных 1-й группы новообразованные сосуды в швартах обнаруживались уже на 7-е сутки, у животных 2-й группы единичные новообразованные сосуды выявлялись лишь на 14-е сутки. Однако статистически значимое увеличение количества новообразованных сосудов к концу периода наблюдения (21-е сутки) было отмечено в обеих группах.

Таким образом, интравитреальное введение мононуклеаров крови в эксперименте индуцирует развитие витреоретинальной пролиферации, выраженность которой зависит от функциональной активности данных клеток. Функционально активные мононуклеары крови индуцируют выраженную фиброваскулярную пролиферативную реакцию в полости глазного яблока с усилением дегенеративных изменений структуры сетчатки. Мононуклеары, инактивированные в условиях гипотермии, вызывают, преимущественно, повреждение внутренних слоев сетчатки с образованием эпиретинальной пролиферативной мембраны.

Результаты экспериментов in vitro  В процессе культивирования in vitro мононуклеаров крови в условиях направленного движения питательной среды получены следующие результаты.

Спустя 24 ч. — культура мононуклеаров на фильтре была представлена прочно адгезированными к субстрату клетками округлой формы, с крупным ядром, иногда с зубчатым впячиванием. Ядерно-цитоплазматическое отношение около 1. Цитоплазма базофильная. Цитохимически в клетках отмечалась высокая активность α-нафтилацетатэстеразы, блокируемая фторидом натрия (табл. 2). Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась.

Спустя 48 ч. в клетках отмечалось повышение активности α-нафтилацетатэстеразы (pU<0,01). При проведении реакции с фторидом натрия на фильтре были обнаружены единичные элементы, в которых активность неспецифической эстеразы не подавлялась (табл. 2). Исследование на щелочную фосфатазу выявило ее умеренную активность в некоторых клетках. По большинству морфологических параметров указанные клетки относятся к молодым формам фибробластической популяции.

Спустя 72 ч. культура клеток на фильтре состояла из макрофагов и лимфоцитов. Ядро почковидной или округлой формы, с зубчатым впячиванием. Ядерно-цитоплазматическое отношение менее 1. Среди лимфоцитов и макрофагов были обнаружены единичные, крупных размеров клетки неправильной, веретенообразной формы. Цитохимически в указанных клетках отмечалась более высокая активность α-нафтилацетатэстеразы по сравнению с показателями через 48 ч. культивирования (pU<0,01) (табл. 2). Активность неспецифической эстеразы не подавлялась фторидом натрия. В подобных клетках отмечалось также повышение активности щелочной фосфатазы по сравнению с данными через 48 ч. от начала эксперимента (pU<0,01) (табл. 2).  

Морфологические и цитохимические параметры указанных клеток соответствовали активно синтезирующим фибробластам. При исследовании полупроницаемого фильтра, на котором культивировались клетки, в его структурах были выявлены соединительнотканные волокна в виде тонких длинных тяжей.

Таблица 2.

Цитохимическая активность мононуклеаров крови при культивировании in vitro в условиях направленного движения жидкости (у.е.о.п.), X, pU

Цитохимическая реакция

Сроки культивирования, часы

24

48

72

Неспецифическая эстераза

63,81

69,17

p0

73,39

p1

Фторид-резистентная неспецифическая эстераза

0

64,93

71,45

p0

Щелочная фосфатаза

0

40,17

69,07

p0

Примечание: статистически значимые различия отмечены (p0<0,01) при сравнении с исходными показателями;(p1<0,01) при сравнении с показателями в динамике эксперимента

 

В процессе культивирования мононуклеаров крови в стационарных условиях получены следующие результаты. На протяжении всей серии экспериментов (24, 48, 72 ч.) клеточная культура на фильтре была представлена клетками округлой формы, с бобовидным или круглым ядром, с зубчатым впячиванием. Ядерно-цитоплазматическое отношение около или менее 1. Цитохимически в клетках отмечалась умеренная активность α-нафтилацетатэстеразы, которая постепенно повышалась в процессе культивирования (pU<0,05), что связано с дифференцировкой моноцитов в макрофагальные клетки (табл. 3).

Таблица 3.

Сравнительная характеристика активности a-нафтилацетатэстеразы мононуклеаров крови при культивировании in vitro в различных условиях (у.е.о.п.), X, pU

Условия культивирования

Сроки культивирования, часы

24

48

72

Биореактор

 in vitro

63,81

n=25

69,17

p0

n=25

73,39

p0

n=25

Стационарная

культура

62,38

n=25

63,95

n=25

64,08

n=25

Примечание: статистически значимые различия отмечены (p0<0,01) при сравнении с результатами культивирования в стандартных условиях; n — количество подсчитанных клеток

 

Активность неспецифической эстеразы ингибировалась фторидом натрия. Щелочная фосфатаза в культивируемых клетках не выявлялась.

Таким образом, при культивировании мононуклеаров крови in vitro в условиях направленного движения питательной среды отмечается повышение их внутриклеточной ферментативной активности. При модулирующем влиянии факторов микроокружения (направленный поток жидкости, внеклеточный матрикс) ускоряется процесс созревания моноцитов в макрофаги, а обнаруживаемых среди них молодых мезенхимальных клеток — в зрелые формы, продуцирующие коллаген.

    Обсуждение  Воспаление — это эволюционно сложившаяся реакция клеток на антиген, т.е. чужеродную генетическую информацию [5]. В качестве антигена могут выступать любые макромолекулы как экзогенного происхождения (чаще всего инфекционного — бактерии, риккетсии, вирусы, грибы, паразиты; донорский материал), так и эндогенного, вызванного повреждающим действием либо физических (механическая, термическая, лучевая энергия), либо химических факторов (кислоты, щелочи, отравляющие вещества и т.д.). Довольно часто в качестве антигена могут выступать собственные ткани организма. В этом случае речь идет об аутоиммунном заболевании.

Манифестация аутоиммунного деструктивного процесса инициируется патогенными факторами на фоне внутренних предрасполагающих факторов. В условиях срыва естественной толерантности аутоантигены клеток и межклеточного матрикса становятся объектом распознавания аутореактивными мононуклеарами с развитием в дальнейшем классического иммунного ответа. Чаще всего это наблюдается при наличии какого-либо предшествующего патологического процесса, приводящего к альтерации тканей и хроническому воспалению [2, 5].

В полости глазного яблока одной из наименее изученных областей является плоская часть цилиарного тела и прилегающая к ней периферическая часть сетчатки, играющие, однако важную роль в развитии многих заболеваний глаза.

На том этапе эмбриогенеза, когда глазной бокал приближается к поверхностной эктодерме боковых стенок головного конца зародыша, в этом участке формируется хрусталиковая пластинка, которая при помощи тонких плазматических спаек соединяется с нервной эктодермой глазного бокала [6-8]. Эти две ткани становятся несовместимыми друг для друга, что вызывает развитие аутоиммунного воспалительного процесса. Здесь происходит гибель части клеток глазного бокала, что в последующем ведет к развитию слепой части сетчатой оболочки, в то время как в остальной — зрительной — части эпителий утолщается и становится многослойным. В результате в сетчатке формируется зона разграничения — зубчатая линия (ora serrata) [6-8]. Здесь же берет начало и стекловидное тело. Будучи экто- и мезодермальным по происхождению, стекловидное тело становится антигеном для сетчатки, что и создает предпосылки для развития периферического увеита.

Периферический увеит представляет собой хроническое аутоиммунное воспаление, центральной фигурой которого, как уже отмечалось, являются мононуклеары. Результаты проведенных экспериментальных исследований позволяют предположить следующие механизмы поражения центральных отделов сетчатки на фоне данной патологии. Флогогенные факторы, вырабатываемые мононуклеарами в очаге хронического воспаления на крайней периферии глазного дна, вместе с током внутриглазной жидкости от цилиарного тела к заднему полюсу достигают ретинальных сосудов и блокируют миогенную ауторегуляцию на уровне микроциркуляторного русла [9]. Следствием этого является нарушение движения тканевой жидкости от хориоидеи к сосудам сетчатки и развитие экссудативной отслойки сетчатки.

Кроме того, при прогрессировании воспалительного процесса на крайней периферии глазного дна вследствие экссудации мононуклеары мигрируют в витреальную полость, адгезируют к волокнам стекловидного тела и оказываются на пути движения внутриглазной жидкости. Одной из основных функций клеточной поверхности и плазматической мембраны является восприятие и передача внешних сигналов внутрь клетки. Благодаря этому во многом реализуется взаимосвязь между функцией клеточной мембраны, ее проницаемостью и степенью активности процессов внутриклеточного метаболизма. Модулирующие факторы внеклеточной среды действуют как экзогенные регуляторные сигналы, контактируя с рецепторами клеточной поверхности. Подобным экзогенным сигналом для адгезированных к фибриллам стекловидного тела клеток может служить направленное движение внутриглазной жидкости, что подтверждается результатами экспериментальных исследований in vitro.

После взаимодействия внешних сигналов с клеточными рецепторами происходят изменения в структуре связанных с ними мембранных ферментов, катализирующих синтез эндогенных регуляторных молекул. Вследствие этого происходит сдвиг в концентрации данных молекул и повышение проницаемости клеточной поверхности.

Кроме того, плазмалемма играет роль первичного клеточного анализатора, избирательно регулируя транспорт химических веществ в клетки. Все макромолекулы, такие как белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липопротеидные комплексы поступают в клетку путем формирования и слияния пузырьков, т.е. с помощью эндоцитоза. Выделение же синтезированных в клетках веществ происходит через плазматическую мембрану уже с противоположной стороны клетки (по пути движения жидкости) посредством экзоцитоза. Благодаря этим двум процессам осуществляется тесная связь вакуолярного аппарата клеток с внеклеточной средой.

Поскольку микроокружение оказывает модулирующее влияние как на поверхностные свойства клеток, так и на их жизнедеятельность, то наличие направленного движения жидкости через клетки усиливает в них процессы эндо— и экзоцитоза. Это в свою очередь отражает возросшую активность биохимических внутриклеточных процессов, что подтверждается результатами культивирования мононуклеаров в проточных условиях. Цитохимически в ходе экспериментов в клетках, по сравнению с показателями в статических условиях, отмечено существенное повышение активности как специфических, так и неспецифических для них ферментных систем.

Необходимо отметить, что изменения внутриклеточных биохимических процессов сопряжены с активацией и инактивацией различных наборов генов, обеспечивающих клеточный гомеостаз и гомеокинез. Изменение же экспрессии генов в свою очередь инициирует реализацию именно дифференцировочного потенциала клеток. В результате, при модулирующем влиянии факторов микроокружения (направленный поток жидкости, внеклеточный матрикс) ускоряется процесс дифференцировки моноцитов в макрофаги, а молодых мезенхимальных клеток — в зрелые, коллагенсинтезирующие формы.

Далее в патологическом очаге, в соответствии с влиянием микроокружения и гуморальных стимулов макрофагов и лимфоцитов, фибробласты начинают процесс фиброгенеза, включающий продукцию гликозаминогликанов, биосинтез коллагена, активный фибриллогенез. Синхронно с ростом фиброзных волокон отмечается рост новообразованных сосудов, поскольку факторы, секретируемые макрофагами, лимфоцитами и другими клетками, не только воздействуют на фибробласты, но и стимулируют неоваскулогенез. В результате в центральных отделах глазного дна отмечается быстрое развитие фиброваскулярных пролиферативных мембран.

Таким образом, полученные в ходе экспериментальных исследований данные расширяют представления о влиянии микроокружения на морфофункциональный статус мононуклеаров и позволяют с новых позиций подойти к изучению клеточных механизмов поражения центральных отделов глазного дна на фоне периферического увеита.

Работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для молодых ученых № МК-2650.2012.7.

 

И.В. Запускалов, О.И. Кривошеина, Ю.И. Хороших 

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск 

Кривошеина Ольга Ивановна — доктор медицинских наук, профессор кафедры офтальмологии

 

 

Литература:

1. Kansky J.J. Diseases of the macula // A practical approach. — Mosby International limited, 2002. — P. 19-35.

2. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. — М.: Медицина, 1991. — 272 с.

3. Кривошеина О.И. Клеточные механизмы развития пролиферативной витреоретинопатии (экспериментально-клиническое исследование): дис. … д-ра мед. наук. — Томск, 2004. — 251 с.

4. Марченко И.Ю., Сычев Г.М., Степанова Л.В. Стекловидное тело как зона интенсивного обмена жидкости // Бюлл. ВСНЦ СО РАМН. — 2004. — № 2. — С. 52-55.

5. Климов В.В., Кологривова Е.Н., Черевко Н.А. Клиническая иммунология и аллергология. — Томск: СибГМУ, 2006. — 180 с.

6. Карлсон Б. Основы эмбриологии по Пэттену / В 2 т. // пер. с англ. — М.: Мир, 1983.

7. Кнорре А.Г. Эмбриональный гистогенез. — Л.: Медицина, 1971. — 432 с.

8. Пэттен Б.М. Эмбриология человека.— М.: Медгиз, 1959. — 768 с.

9. Запускалов И.В., Кривошеина О.И. Механика кровообращения глаза. — Томск: СибГМУ, 2005. — 112 с.