Патология шейки матки, связанная с воспалительными заболеваниями, предопухолевыми и опухолевыми процессами, составляет значительную часть гинекологических заболеваний. Частота рака шейки матки неуклонно растет, несмотря на возможности визуальной оценки состояния шейки, причем наиболее значительно частота рака увеличивается среди молодых женщин. Важно и то, что увеличивается, прежде всего, число больных с запущенными стадиями опухолевого процесса. Это является прямым свидетельством недостаточной эффективности существующих скрининговых тестов, а, возможно, и отсутствием самой системы скрининга. В настоящее время четко обозначена роль высокоонкогенных типов вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии предрака и рака шейки матки. Но главная проблема состоит в том, что обнаружение вируса еще ничего не значит, т.к. рак разовьется только у 4-5% женщин.
ВПЧ может инициировать и поддерживать хронические воспалительные процессы шейки матки, поскольку при ВПЧ-индуцированном изменении структуры эпителия создаются предпосылки для манифестации бактериальных, вирусных, протозойных, грибковых и других инфекций [16].
Исследования последних лет показали, что большинство женщин на протяжении жизни инфицируется вирусами ВПЧ. Так, например, до 82% женщин считаются инфицированными уже через 2 года после сексуального дебюта [4], при этом даже при одном партнере 20% женщин заражены [5]. С течением времени вирус преимущественно элиминируется из организма самостоятельно, но у части женщин отмечается его персистирующее носительство. ДНК ВПЧ сохраняется в эпителии долгое время и при воздействии факторов риска рано или поздно приводит к развитию предрака и РШМ. Факторами риска являются ранее начало половой жизни, наличие большого числа половых партнеров, заболевания, передающиеся половым путем, авитаминоз, снижение иммунитета, стрессы, курение, алкоголь.
Механизм канцерогенеза начинает работать при целом ряде условий: 1) активная экспрессия генов Е6 и Е7 вируса, 2) индукция метаболических механизмов конверсии эстрадиола в 16a-ОН, 3) индукция множественных повреждений хромосомной ДНК в инфицированной клетке, которая завершает процесс перерождения.
Ключевым событием является интеграция вируса папилломы 16 и 18 типов в геном клетки, что сопровождается активацией синтеза онкобелков Е6, Е7. Существует киназа Е2Р, которая обеспечивает прохождение клетки из G 1 в S фазу клеточного цикла. В норме она неактивна, находясь в связанном состоянии с белком супрессором Rb. Белок р16ink4a осуществляет контроль разобщения комплекса E2F-Rb, не допуская безудержной пролиферации клетки. Белок Е7 вируса папилломы человека высокого онкогенного риска при своем взаимодействии с продуктом гена ретинобластомы приводит к разобщению комплекса E2F-Rb. Е2Р остается постоянно в активном состоянии, стимулируя безудержную пролиферацию клетки. Белок р16ink4a пытается сдержать пролиферацию клетки, что приводит к постоянному его синтезу [8, 9, 10, 11]. Сверхэкспрессия p16INK4A и его накопление в цитоплазме является признаком поражения шейки матки и может служить ранним маркером РШМ [17].
В настоящее время общепризнано участие эстрогенов и/или их метаболитов в развитии неопластических процессов в тканях шейки матки и в повреждении ДНК: образовывать аддукты, усиливать расплетение её цепей, инициировать разрывы и т.д., что может приводить к изменениям на уровне клеточного генома. Известно, что превращение эстрогенов происходит под контролем специальной монооксигеназной системы печени, представленной ферментами цитохрома Р-450. Таким образом, эстрадиол превращается в две формы с абсолютно противоположными биологическими эффектами: 2-гидроксиэстрон не влияет на пролиферацию клеток, в то время как 16-α-гидроксиэстрон стимулирует рост клеток и является агонистом эстрогенов. В результате образуются прочные ковалентные связи с эстрогеновыми рецепторами и, как следствие, длительное пролонгирование пролиферативного гормонального сигнала [4]. При этом индуцируются оба механизма эстогензависимого канцерогенеза: усиленная клеточная пролиферация и генотоксические повреждения наследственного аппарата [18].
У женщин, инфицированных ВПЧ, 16-α-гидроксиэстрон играет важную роль в малигнизации пролиферативного процесса, приводя к развитию рака шейки матки. Вирус модифицирует клеточный метаболизм таким образом, что клетка приобретает способность превращать эстрадиол преимущественно в 16-αОНЕ1, который является прямым активатором экспрессии гена Е7, ответственного за опухолевую трансформацию клеток.
Понимание механизма функций этих двух метаболитов позволило выявить тесную связь между уровнем 16-α-гидроксиэстрона и риском развития опухолей в эстрогензависимых тканях. В то же время повышение уровня 2-гидроксиэстрона приводит к гибели опухолевых клеток и предупреждает их дальнейшее образование. Многочисленные экспериментально-клинические исследования доказали необходимость в поддержании баланса между этими метаболитами, при этом концентрация 2-гидроксиэстрона должна превышать концентрацию 16-а-гидроксиэстрона как минимум в 2 раза. Поэтому отношение 2-гидроксиэстрона к 16-а-гидроксиэстрону является универсальным биомаркером и надежным диагностическим критерием для определения риска и прогноза развития эстрогензависимых опухолей.
Кроме того, было установлено, что там, где наблюдается активная экспрессия белков ВПЧ, отмечен высокий уровень синтеза 16-а-гидроксиэстрона. Таким образом, инфицирование эпителиальных клеток вирусом является необходимым, но недостаточным условием для их ракового перерождения. Для этого, помимо активной экспрессии онкогенов Е6 и Е7, необходима индукция метаболических механизмов конверсии эстрадиола в канцерогенный 16-α-гидроксиэстрон. Последний, индуцируя дальнейший процесс малигнизации, вызывает множественные повреждения хромосомной ДНК в инфицированной клетке. Из многочисленных исследований следует, что один из основных путей малигнизации заключается в том, что вирус модифицирует клеточный метаболизм таким образом, что клетка приобретает способность превращать эстрадиол преимущественно в 16-а-гидроксиэстрон, являющийся прямым активатором экспрессии гена Е7, ответственного за опухолевую трансформацию клеток (Киселев В.И., Ляшенко А.А., 2005). В результате формируется порочный круг, при котором вирус через образование агрессивной формы эстрадиола создает благоприятные условия для развития опухоли, стимулируя синтез онкобелка Е7.
Вирусный геном может персистировать в опухолевых клетках в эписомальной или интегрированной форме. Онкогены Е6 и Е7 экспрессируются в опухолевых клетках, направляя синтез соответствующих белков, которые вызывают нестабильность клеточного генома и нарушают работу генов, контролирующих размножение клеток, таких, как гены-супрессоры, гены-регуляторы клеточного цикла. Эти изменения приводят к серии определенных эпигенетических изменений. Важнейшим из них является метилирование генов-супрессоров. В целом процесс метилирования генов является физиологическим. Это механизм разпознавания «свой- чужой», т.е. возможность поддержания стабильности генома. Но в клетке, инфицированной вирусом, процесс метилирования изменяется, возможно гиперметилирование отдельных островков, или деметилитрование генов, что разрушает защитную функцию клеток-супрессоров и не останавливает избыточную прорлиферацию.
Раку шейки матки предшествуют цервикальные интраэпителиальные неоплазии CIN, которые по степени тяжести разделяют на CIN 1 (легкая дисплазия), CIN II (умеренная дисплазия), CIN III (тяжелая дисплазия и Са in situ). 91% легких дисплазий, выявленных на Пап-мазках, самопроизвольно регрессируют в течение 36 месяцев и только 3% переходят в тяжелую дисплазию [19].
В диагностике патологии шейки применяются различные методы, но наиболее доступными для практики считают использование расширенной кольпоскопии, клинико-визуального метода, молекулярно-биологических методов исследования (ПЦР) для определения специфических инфекций (ВПЧ 16/18 типов, ВПГ, ЦМВ, хламидий, микоплазм, уреаплазм), цитологического исследования мазков из шейки матки и морфологического исследования прицельно взятого биоптата. Наиболее распространенным для диагностики патологии шейки матки является цитологический метод. Информативность данного метода определяется уровнем подготовки специалистов, а также полноценностью забора материала для цитологического исследования, так как неправильный забор повышает частоту ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
В настоящее время все большее распространение получает новая технология приготовления цитопрепаратов, так называемая жидкостная цитология. Важной технологической особенностью метода жидкостной цитологии (ЖЦ), улучшающей качество исследования, является то, что исследуемый материал берется в специальный стабилизирующий раствор, который обеспечивает его сохранность без разрушения и потери клеток. При этом весь клеточный материал сохраняет без изменения свои морфологические и иммуноцитохимические свойства. В последние пять лет в раз-ных странах проводилось много исследований, в которых сравнивалась эффективность традиционной техники и ЖЦ, используя для подтверждения диагнозов гистологическую экспертизу, как «золотой стандарт» и оценку цитопрепаратов согласно классификации TBS (The Bethesda System). В исследовании участвовали как поликлинические, так и стационарные отделения, обследовавшие тысячи пациентов (Grace A et al. Cytopathology 2002.). По обобщенным данным чувствительность традиционного метода колеблется в широком диапазоне значений: 34,5 – 89 %; а для метода ЖЦ имеет более стабильные значения: 71,4 – 95 %. Соответственно специфичность методов составляла: 36 – 76,9 % и 58 – 76,2 %.
Однако рутинное цитологическое исследование мазков дает нам информацию о состоянии шейки матки на настоящий момент, но оно не способно оценить онкогенный потенциал изменений в тех случаях, когда не выявляется рак. Таким образом, применение только цитологического метода недостаточно для скрининга рака шейки матки.
В последние годы в качестве дополнительного метода диагностики патологии шейки матки применяется определение ДНК вируса папилломы человека методом ПЦР. Но, несмотря на высокую чувствительность метода, специфичность данного подхода оказалась низкой [9]. Скрининг ВПЧ инфекции может идентифицировать пациенток с низким риском развития рака шейки матки в случае негативного теста, но ПЦР ВПЧ бесполезна для обнаружения пациентов с высоким риском прогрессии. Для достижения этой цели необходим тест, позволяющий выявить проявление онкогенного потенциала вируса — таким образом, наше внимание должно быть перенесено от агента к хозяину (Miller AB. Lancet 2001).
Попытки усовершенствовать раннюю диагностику рака шейки матки в настоящее время сосредоточены на поиске генов, экспрессия которых в дисплазиях и карциномах меняется под действием онкобелков вируса. Одним из таких генов является ген INK4a, кодирующий белок р16ink4a. Иммуноцитохимически он проявляется позитивной реакцией, что является биомаркером инициации канцерогенеза в эпителии шейки матки (Nieh S., Chen S.F., Chu T.Y.et al. Gynecol Oncol. 2003).
Было достоверно показано, что экспрессия р16 связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (с внутриэпителиальными плоскоклеточными поражениями шейки матки как высокой, так и низкой степени — LSIL и HSIL соответственно классификации ВОЗ). В целом, экспрессия р16 в плоском эпителии не характерна для ситуаций без признаков дисплазии (Bibbo M. et al. Acta Cytol 2002). И хотя отмечается четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазией, имеется большое количество ПЦР-позитивных ВПЧ случаев (с эписомальной локализацией ВПЧ), в которых, при последующем гистологическом исследовании отсутствовал предрак и рак (Nieh S., Chen S.F.,Chu T.Y.et al Gynecol Oncol. 2005). Данное явление подтверждалось негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4α в диспластических клетках.
Таким образом, иммуноцитохимическое определение экспрессии р16 на мазках, приготовленных при помощи жидкостной цитологии, может позволить:
1. Достоверно оценивать потенциал дисплазии в отношении развития рака шейки матки и, соответственно, выбирать более консервативную или более агрессивную тактику лечения;
2. Уточнять заключения цитолога. Дополнительному исследованию на р16 подлежат все случаи атипической цитологии (кроме инвазивного рака шейки матки), неопределенные цитологические заключения (атипические клетки плоского эпителия неясного значения-ASCUS) и все изменения железистого эпителия (Murphy N. , Heffron B., King B. et al. Virchows Arch 2004);
3. Разрешать спорные вопросы при выявлении гинекологом высокоаномальной кольпоскопической картины, не сопровождающейся изменениями в цитологическом мазке;
4. Во многих случаях обоснованно отказаться от биопсии;
5. У большинства пациенток пожилого возраста с цитологической картиной дисплазии на фоне атрофического цервицита обоснованно избрать выжидательную тактику, отказавшись не только от лечения, но и от биопсий, и увеличить интервалы между диспансерными осмотрами. У небольшого числа р16-позитивных пациенток этой возрастной группы, напротив, обоснованно избрать более активную тактику;
6. Определять индивидуальную тактику в отношении пациенток, инфицированных штаммами вируса папилломы человека высокого онкогенного потенциала, если у них нет цитологических и кольпоскопических изменений. У женщин с позитивной ПЦР на HPV выделить группу пациенток, у которых уже инициирован канцерогенез в эпителии шейке матки, и направить на них необходимое лечебное воздействие. Соответственно в более многочисленной группе р16 негативных женщин необходимо продолжить мониторинг;
7. Усовершенствовать мониторинг пациенток, прошедших органосохраняющее лечение по поводу «тяжелой дисплазии» или «рака in situ», добавив определение р16 к рутинному цитологическому исследованию. Это позволит у пациенток наиболь-шего риска повысить чувствительность цитологического исследования и тестировать персистирующую папилломавирусную инфекцию до появления морфологических изменений.
Проведенные нами исследования показали, что Белок р16 ink4α является надежным маркером, позволяющий достоверно оценивать потенциал дисплазии в отношении развития рака шейки матки и выбирать консервативную или оперативную тактику лечения. Гиперэкспрессия р16 ink4a в дисплазиях шейки матки может служить индикатором ВПЧ — индуцированного канцерогенеза.
Так, при обследовании 748 женщин дисплазия эпителия шейки матки различной степени выявлена у 176, из них положительный тест на белок р16 ink4a — у 65 (36,9%). После проведенной электроэксцизии шейки матки среди больных с цитологическими признаками легкой дисплазии и позитивным р16 результатом при морфологическом исследовании установлена тяжелая дисплазия и Са in situ в 52 % случаев, при цитологическом диагнозе дисплазия средней степени тяжести — тяжелая форма дисплазии и Са in situ морфологически обнаружены у 80% больных, а при цитологически тяжелой дисплазии начальныеформы рака шейки и тяжелая дисплазия подтверждены у 91 % женщин.
Таким образом, иммуноцитохимическое исследование p16ink4a в сочетании с жидкостной цитологией является эффективным скринингом рака шейки матки по сравнению с традиционной цитологией и ПЦР-анализом ВПЧ высокого онкогенного риска.
Л.И. Мальцева, доктор мед. наук проф.
Г.А. Раскин, кандидат мед. наук
Л.Н. Фаррахова
А.В. Ахметзянова
Литература:
1. Волгарева, Г.М., Завалишина, Л.Э., Франк, Г.А и др. Экспрессия белкового маркера р16 ink4a в раке шейки матки// Архив патологии-2002.- Т.64. Вып.1. — С. 22-24.
2. Волгарева, Г.М., Завалишина, Л.Э., Андреева, Ю.Ю. и др. Гиперэкспрессия клеточного белка р 16 ink4a в эпителиальных злокачественных опухолях, индуцированных вирусами папиллом человека // Архив патологии-2008.-NQ5.- С. 57-61.
З. Калинин, В.Л. Введение в молекулярную вирусологию. — СПб.: Изд-во СПБГТУ, 2002. З02 с.
4. Киселев, В.И., Ашрафян, Л.А и др. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки, генетические и патогенетические механизмы, возможности терапии и профилактики // Гинекология. — 2004. – Т. 6.- №4. — С. 174-180.
5. Профилактика рака шейки матки: Руководство для врачей / В.И. Кулаков, Й. Паавонен, Прилепская В.Н. и др. — М: МЕДпресс-информ, 2007. — 56 с.: ил.
6. Роговская, С.И. Папилломавирусная инфекция нижних отделов гениталий: клиника, диагностика, лечение. Автореф. дис …. док. мед. наук. — 200З.
7. Шипицина Е.В., Бабкина КА, Оржесковская Е.А и др. Папилломавирусная инфекция: факторы риска цервикальной неопластической прогрессии // Журнал акушерства и женстких болезней. — 2004.- t’LIII.-№З. — С. З4-41.
8. Helt АМ., Galloway D.A.// Сarсiпоgепеsis.200З.-Vоl.24.-Р.159-169
9. Meyer, J.L., Hanlon, D.W., Andersen, ВТ. et al. Evaluation of p16INK4a expression in ThinPrep cervical specimens with the CINtec p16INK4a assay: сопеlаtiоп with biopsy followир results // Cancer. — 2007. — У. ] 11(2). — Р. 83-92;20
10. Ostor, А Natural histori of cervical intraepithelial neoplasia: а critical review// Int J Gynecol. Patho11993; 12: 186-92
11. Rocco, J.W., Sidransky, D. p16(MTS-l/СDКN2/INК4а) in cancer progression.l/ Ехр Cell Res. — 2001. — У.264 — Р.42-55; 7
12. Ronco, О., Cuzick, J., Pierotti, Р. et al. Accuracy of liquid based versus conventional cytology: overall results of new technologies for cervical cancer screening: randomised controlled trial. BMJ. — 2007. — У. 335(7609). — Р. 28 — 38;19
13. Sano, т., Оуата, Т., Kashiwabara, К., Fukuda, Т., Nakajima, Т. Immunohistochemical overex-pression of р 16 protein associated with intact retinoblastoma protein expression in cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia // Pathol Int. — 1998. — У.48 — Р.580-5;8
14. Sankaranarayanan, R., Gaffikin, L., Jacob, М. et al. А critical assessment ofscreening methods for cervical neoplasia // Int J Gynecol. Obstet. 2005; 89:780-6
15. World, Health Organization (WHO). Comprehencive Cervical Cancer Control. А guide to essential practice. Geneva: WHO 2006.
16. Роговская, Р.И. Прилепская, В.Н.. Гинекология . 2006; 8 (1)
17. Ivanova, T.A, Golovina, D.A, Zavalishina, L.E, Volgareva, G.M, Katargin, A.N, Andreeva, Y.Y, Frank, G.A, Kisseljov, F.L, Kisseljova, N.P. Up-regulation of expression and lack of 5′ CpG island hypermethylation of p16 INK4a in HPV-positive cervical carcinomas. BMC Cancer. 2007 Mar 14;7:47.
18. Lord, R.S., Bongiovanni, B., Bralley, J.A. // Altern/ Med. Rev/ — 2002.- Vol.7, №2. – P.112-129
19. Moscicki, A.B. et al. Lancet 2004; 364: 1678-83.
