Первые случаи криптококкоза в Республике Татарстан


Е.Н. ШАХБАЗОВА1, Е.Н. ЖАДЬКО1, Е.Ю. КОТЛЯР1, О.С. ЗАХАРОВА1, Л.Н. КИЛИНА1, Ф.Н. НАГИМОВА1, Н.И. ГАЛИУЛЛИН1, М.П. ШУЛАЕВА2, О.К. ПОЗДЕЕВ2,3

1Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, 420097, г. Казань, ул. Вишневского, д. 2а

2Казанская государственная медицинская академия, кафедра микробиологии, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 36

3Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49

Шахбазова Елена Николаевна — заведующая лабораторией микробиологии, тел. (843) 238-41-81, e-mail: lenashakhbazova@yandex.ru1


Жадько Екатерина Николаевна — врач-бактериолог, тел. (843) 238-41-81, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Котляр Елена Юрьевна — кандидат биологических наук, врач-бактериолог, тел. (843) 238-41-81, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Захарова Ольга Сергеевна — врач-бактериолог, тел. (843) 238-41-81, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Килина Лилия Николаевна — заместитель главного врача, тел. (843) 238-77-04, e-mail: centre_spid@tatar.ru1


Нагимова Фирая Идиятулловна — кандидат медицинских наук, заместитель главного врача, тел. (843) 238-19-06, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Галиуллин Нияз Ильясович — кандидат медицинских наук, главный врач, тел. (843) 238-19-06, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Шулаева Марина Петровна — кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, тел. (843) 233-34-78, e-mail: shulaeva.m@mail.ru2

Поздеев Оскар Кимович — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрами микробиологии КГМА и КГМУ, тел. (843) 233-34-78, e-mail: pozdeevoskar@rambler.ru2,3

В статье представлены результаты обследования 103 ВИЧ-инфицированных пациентов, рассмотрены вопросы микологического обследования всех больных с клиническими диагнозами «менингит» и «менингоэнцефалит». Дана характеристика бактериоскопических, культуральных и иммунологических методов исследования клинического материала, полученного от пациентов: ликвора и сыворотки. Получены новые данные о выделении у ВИЧ-инфицированных больных патогенного гриба рода Cryptococcus, частота выделения которого связана с возрастными и половыми особенностями пациентов, а также с клинической картиной заболевания. Доказана роль криптококкоза как СПИД-маркерного заболевания. Проведен мониторинг определения антимикотических препаратов при выборе лечения криптококкоза.

Ключевые слова: криптококк, ликвор, сыворотка, ВИЧ-инфицированные, антимикотические препараты.

 

E.N. SHAKHBAZOVA1, E.N. ZHAD’KO1, E.Yu. KOTLYAR1, O.S. ZAKHAROVA1, L.N. KILINA1, F.N. NAGIMOVA1, N.I. GALIULLIN1, M.P. SHULAYEVA2, O.K. POZDEYEV2,3

1Republic Center for PreventionandCountercation to AIDS and Infectious Diseases, 2a Vishnevskiy St., Kazan, Russian Federation, 420097

2Kazan State Medical Academy, 36 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420012

3Kazan State Medical University, 49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation, 420012

First cases of Cryptococcus in Tatarstan Republic

Shakhbazova E.N. — Head of Microbiology Laboratory, tel. (843) 238-41-81, e-mail: lenashakhbazova@yandex.ru1

Zhad’ko E.N. — bacteriologist, tel. (843) 238-41-81 e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Kotlyar E.Yu. — Cand. Biol. Sc., bacteriologist, tel. (843) 238-41-81, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Zakharova O.S. — bacteriologist, tel. (843) 238-41-81, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Kilina L.N. — Deputy Chief Doctor, tel. (843) 238-77-04, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Nagimova F.I. — Cand. Med. Sc., Deputy Chief Doctor, tel. (843) 238-19-06, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Galiullin N.I. — Cand. Med. Sc., Chief Doctor, tel. (843) 238-19-06, e-mail: centre_spid@tatar.ru1

Shulayeva M.P. — Cand. Biol. Sc., Associate Professor of the Department of icrobiology, tel. (843) 233-34-78, e-mail: shulaeva.m@mail.ru2

Pozdeyev O.K. — D. Med. Sc., Professor, Head of the Department of Microbiology of KSMA and KSMU, tel. (843) 233-34-78, e mail: pozdeevoskar@rambler.ru2,3

The article presents the results of a survey of 103 HIV-infected patients. The considered issues are the mycological research of all patients with clinical diagnosis of meningitis and meningoencephalitis. The characteristic is presented of bacterioscopic, strain and immunological methods of research of the clinical material obtained from patients, namely CSF and serum. New data are obtained of the selection pathogenic fungus of Cryptococcus from HIV-infected patients. Frequency of Cryptococcus allocation is associated with age and sex of patients, as well as with the clinical pattern of the disease. The role of cryptococcosis as AIDS-marking disease is proved. The monitoring of the antimycotics sensitivity was held when choosing the Cryptococcus treatment.

Key words: Сryptococcus, cerebrospinal fluid, serum, HIV-infected, antifungal preparations.

 

Долгое время криптококкоз считался редким заболеванием. В 1970 г. Л. Анжело (L. Angello) писал, что фактическая частота этой инфекции намного превышает количество регистрируемых случаев и образно назвал криптококкоз «пробуждающимся гигантом» среди системных микозов. Это предсказание оказалось пророческим. С ростом заболеваемости ВИЧ-инфекцией и последующим развитием у пациентов СПИД резко увеличилась частота регистрации криптококкоза в мире. Криптококкоз настолько часто осложняет течение СПИД, что некоторые авторы говорят о существовании ассоциации «криптококкоз+СПИД» и делают вывод о целесообразности обследования на СПИД всех больных криптококкозом; в равной мере и всех больных СПИДом следует проверять на криптококкоз. Данные о частоте криптококкоза в России отсутствуют, в последние годы отмечен рост числа случаев с летальными исходами в Санкт-Петербурге [1].

Возбудителем является капсулированный дрожжевой гриб Cryptococcus neoformans (Sanfelice, 1894), относящийся к классу базидиомицетов. Род Cryptococcus насчитывает более 70 видов, из них медицинское значение имеют Cr.neoformans и Cr.gatti. Последний вид распространен в странах с тропическим климатом, а в Европе и России доминирует Cr.neoformans. Он включает большое количество вариантов, из которых наиболее частым возбудителем микоза в 90% случаев являются Cr.neoformans var. neoformans и Cr.neoformans var. grubii [2]. Клиническая диагностика криптококкоза затруднена из-за почти полного отсутствия патогномоничных симптомов. Наиболее часто регистрируют поражения ЦНС, соответственно, основными клиническими формами заболевания являются менингиты и менингоэнцефалиты.

Криптококкоз относят к группе оппортунистических инфекций, т.к. естественная устойчивость человека к криптококкам достаточно высокая, о чем свидетельствуют широкая распространенность возбудителя в различных географических зонах и преимущественная заболеваемость лиц с нарушениями иммунного статуса.

Следует отметить, что клинически выраженные формы криптококкоза зарегистрированы у больных лейкозами, саркоидозом, лимфомами, эндокринопатиями, среди пациентов после трансплантации органов, а также лиц, получающих большие дозы цитостатиков или кортикостероидов [3]. Патогенез заболевания остается до конца неизученным, но известно, что практически при любом нарушении клеточного иммунного ответа возбудитель продолжает активно размножаться и в организме больного накапливается большое количество криптококкового полисахаридного антигена, что приводит к активации Т-супрессоров и подавлению иммунного ответа на всех уровнях.

Клиника криптококкоза зависит от локализации и распространенности процесса. По МКБ-10 выделяют легочный криптококкоз, церебральный криптоккоз, криптококкоз кожи, криптококкоз костей. Однако из-за отсутствия типичных клинических признаков, значительная часть случаев остаются нераспознанными и проходят под маской других заболеваний.

Все это указывает на настоятельную необходимость настороженности врачей разных специальностей в отношении криптококкоза и проведения грамотного обследования для постановки диагноза. Ранняя диагностика микоза во многих случаях имеет решающее значение для успешной этиотропной терапии.

Цель исследования — проведение микологического обследования больных ВИЧ-инфекцией с клиническими признаками поражения центральной нервной системы и мониторинг чувствительности к антимикотикам выделенных возбудителей.

Материалы и методы исследования

С августа 2010 до декабря 2013 г. обследованы 103 ВИЧ-инфицированных пациента с диагнозами «менингит» и «менингоэнцефалит», получающие лечение в отделении медико-социальной реабилитации РЦПБ СПИД И ИЗ МЗ РТ г. Казани. Все пациенты разделены по стадиям ВИЧ-инфекции, возрасту и полу.

Стадии ВИЧ-инфекции определяли по приказу МЗ СЗ РФ от 17 марта 2006 года № 166 [4]. На 2В стадии (острая инфекция с вторичными заболеваниями) находились 2 пациента (1,94%), на 3-й стадии (субклиническая стадия) — 11 пациентов (10,7%). На 4-й стадии вторичных заболеваний находились 87,4% — 90 человек: из них: 4А стадии — 8 (7,8%), 4Б стадии — 35 (34%), 4В стадии — 47 (45,6%) пациентов.

Мужчины составили 70% (72 человека), женщины — 30% (31 человек), максимальный возраст — 60 лет, минимальный — 20 лет. Среди обследованных преобладает возрастная категория от 20 до 40 лет (84,5%), старше 40 лет — 15,5% (16 человек).

Исследовано 118 образцов: ликвор — 45 проб, сыворотка — 73 пробы. Забор и доставка материала осуществлялись согласно общим требованиям [5].

Для выделения и идентификации возбудителя использовали общеизвестные микробиологические методы исследования, направленные на получение чистой культуры возбудителя, изучение его биологической характеристики. Бактериоскопическое исследование включало микроскопию нативного препарата ликвора с определением цитоза; тушевого препарата ликвора — для выявления капсульных дрожжевых форм; окрашенного по Граму ликвора — для определения тинкториальных свойств возбудителя, если таковой присутствовал в ликворе.

При культуральном исследовании ликвор засевали на бульонные и плотные питательные среды, которые позволяли выявить рост любых, в том числе прихотливых, микроорганизмов. Использовали агар Сабуро, кровяной (5% бараньей крови) и шоколадный агар, мясо-пептонный бульон (BioRad, Франция), хромогенную среду для выделения грибов (Oxoid, Великобритания). Посевы культивировали трое суток при 37ºС, затем чашки с отсутствием роста выдерживали до 10 суток при комнатной температуре. В течение 10 суток проводили наблюдение за средами обогащения. Идентификацию выделенных грибов до вида проводили с помощью тест-системы Auxacolor 2 (BioRad, Франция). Чувствительность к антимикотикам определяли с применением тест-систем Fungitest (BioRad, Франция ) YeastOne (Sensititre, Великобритания). Иммунологическое исследование было направлено на поиск антигена криптококка в ликворе и сыворотке, который выявляли методом латекс-агглютинации в тест-системе Pasrorex Cryptoplus (BioRad, Франция).

Результаты и обсуждение

В процессе исследования получены следующие положительные результаты: антиген криптококка выявлен в 12,3% сывороток (9 проб), антиген криптококка в ликворе выявлен в 17,7% случаев (8 проб). Сыворотку исследовали только методом латекс-агглютинации для определения антигена криптококка. По литературным данным, обнаружение антигена Cryptococcus spp. в сыворотке больных ВИЧ-инфекцией дает 90%-ное подтверждение диагноза криптококкоза [6].

С конца 2012 г. в лабораторию чаще поступала сыворотка от ВИЧ-инфицированных пациентов для исследования на криптококкоз. Исследование сыворотки на антиген Cryptococcus spp. является своеобразным скрининговым методом в диагностике, так как не всегда удается провести пункцию спинного мозга для получения ликвора от ВИЧ-инфицированного пациента. Поэтому при подозрении на криптококкоз любой локализации всем больным ВИЧ-инфекцией показано определение антигена Cryptococcus spp. в сыворотке.

Из 103 обследованных лиц антиген криптококка выявлен у 13 человек (12,6%). Из них на 3-й стадии заболевания находилось 3 человека (23%), на 4Б стадии — 2 человека (15,4%) и на 4В стадии — 8 человек (61%). Подавляющее большинство больных криптококкозом мужчины — 12 человек (92,3%). 9 пациентов (69,2%) были в возрасте старше 40 лет. 11 больных (84,6%) взяты на диспансерное наблюдение с диагнозом ВИЧ-инфекция сравнительно недавно (менее трех лет), причем более 50% из них были поставлены на диспансерный учет в середине 2013 года.

Достоверный диагноз криптококкоза может быть поставлен только на основании данных, полученных при обследовании больных различными методами. Такое обследование может проводиться в двух основных направлениях — микологическом и иммунологическом.

При микробиологическом исследовании первично проводили микроскопию нативного препарата — чаще наблюдался цитоз в виде лейкоцитов и единичных эритроцитов. В ряде препаратов, где цитоз отсутствовал, выявляли дрожжевые почкующиеся клетки с одной почкой. Количество клеток в поле зрения варьировало от единичных до 5-8, образование цепочек не наблюдали. В случае наличия дрожжевых клеток при микроскопии в капле туши была хорошо видна капсула в виде светлого ободка вокруг дрожжевой клетки. Толщина капсулы во всех образцах была небольшой. Обнаружение капсулы в тушевом препарате указывало на вероятность наличия криптококка. Все пробы ликвора, где были обнаружены дрожжевые клетки, давали положительный результат и в реакции латекс-агглютинации на наличие антигена Cr.neoformans.

Культуральное исследование всех поступивших в лабораторию проб ликвора проводили на выявление бактериального и грибкового роста. Однако во всех случаях, где отмечался рост культуры, получен рост только криптококкка. Высевы со сред обогащения также не давали бактериального роста. На среде Сабуро наблюдали появление колоний беловатого цвета чаще на 3–5-е сутки, иногда на 7-е сутки. На агаре Сабуро криптококки образовывали колонии практически одинакового размера и пастообразной консистенции. На хромогенной среде размер и цвет колоний различался: размер — от мелких до крупных, цвет — от бежевого до различных оттенков коричневого.

Идентификация выросших культур показала, что во всех случаях выделен Cr.neoformans. Типирование вариантов криптококка методом ПЦР не проводили.

Известно, что при отсутствии в препаратах ликвора типичных клеток рекомендуется проводить дополнительное изучение проб СМЖ, взятых повторно, так как при локализованных криптококковых очагах поражения в ЦНС клетки гриба обнаруживаются в СМЖ не всегда. Повторных исследований ликвора при отсутствии положительных результатов не было.

В восьми пробах ликвора был выделен Cr.neoformans. В этих же восьми образцах были обнаружены дрожжевые клетки в нативном препарате и капсулы при микроскопии в капле туши.

Все выделенные штаммы гриба были протестированы на чувствительность к антимикотическим препаратам (табл. 1).

Таблица 1.

Чувствительность к антимикотикам штаммов Cryptococcus neoformans

антимикотикS

(чувствительный)

I

(умеренно-чувствительный)

R (устойчивый)
Амфотерицин В8 (100%)00
Итраконазол8 (100%)00
Миконазол7 (87,5%)1 (12,5%)0
Флюконазол7 (87,5%)1 (12,5%)0
Флюроцитозин5 (62,5%)3 (37,5%)0
Кетоконазол7 (87,5%)1 (12,5%)0

 

При изучении резистентности к антимикотикам штаммов грибов, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов, можно отметить сохранение чувствительности к флюконазолу у 7 пациентов из восьми, лишь в одном случае мы наблюдали умеренную чувствительность к флюконазолу.

По данным литературы, первичная резистентность Cr.neoformans к азоловым антимикотикам развивается редко [6], однако возможно развитие вторичной резистентности при длительной антифунгальной терапии. Поэтому клиницистам нужно помнить, что у таких ВИЧ-инфицированных пациентов необходимо повторно забирать именно ликвор с целью получения роста штамма с обязательной оценкой его чувствительности к антифунгальным препаратам.

У двух из 8 ВИЧ-инфицированных пациентов ликвор и сыворотка забирались неоднократно в течение исследуемого периода. У первого пациента после первичного выделения криптококка и проведенного лечения: в последующем все исследованные пробы были отрицательными. У второго пациента после повторного взятия ликвора на фоне проводимой терапии флюконазолом снова был получен рост криптококков. Но определить чувствительность к антимикотикам с помощью Фунгитеста не удалось, поэтому был использован метод серийных разведений с определением МПК. Установлено наличие умеренной устойчивости к флюконазолу (МПК 16 мкг/мл) и чувствительность к вориконазолу (МПК 0,25 мкг/мл). По результатам анализа пациенту терапия флюконазолом была заменена на вориконазол. Как показали контрольные исследования, гриб продолжал персистировать в организме больного. Причем больной находился на антиретровирусной терапии (АРВТ) с 2009 г., при этом на фоне снижения вирусной нагрузки уровень СД4 клеток оставался низким (<0,03х10*9/л).

На сегодня основные стратегические проблемы терапии ВИЧ-инфекции так или иначе оказываются связанными с появлением резистентности вируса к АРВТ. На фоне снижения эффекта АРВТ у пациентов возможно присоединение тяжелых оппортунистических заболеваний, к которым относится криптококкоз. Так, из 13 обследованных пациентов, у которых был выделен Cryptococcus neoformans, 9 получали АРВТ. Вероятность связи развития у них криптококкоза с резистентностью вируса к АРВТ весьма высока. Возможно, стоит рассмотреть вопрос ранней профилактики криптококкового менингита у ВИЧ-инфицированных пациентов независимо от стадии заболевания с назначением флюконазола.

Выводы

1. Основная часть ВИЧ-инфицированных пациентов (76,4%), которым поставлен диагноз внелегочного криптококкоза, преимущественно мужчины (92,3%) в возрасте от 30 до 40 лет (77%), находилась на стадии вторичных заболеваний.

2. Во всех положительных пробах ликвора Cryptococcus neoformans обнаружен иммунологическими и микологическими методами.

3. Все выделенные штаммы Cryptococcus neoformans имели капсулу небольших размеров.

4. Все выделенные штаммы Cryptococcus neoformans чувствительны к флюконазолу.

5. При длительном применении флюконазола необходим мониторинг за уровнем чувствительности возбудителя к этому препарату.

6. Позднее выявление ВИЧ-инфекции и постановка на диспансерное наблюдение приводят к развитию тяжелых оппортунистических заболеваний, в частности криптококкоза.

7. Необходим скрининг сыворотки ВИЧ-инфицированных больных для выявления антигена криптококка.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Хостелиди С.Н., Сорокина М.М., Борзова Ю.В., Чернопятова Р.М., Богомолова Т.С., Игнатьева С.М., Фролова Е.В., Филиппова Л.В., Авдеенко Ю.Л., Босак И.А., Цинзерлинг В.А., Шурпицкая О.А., Васильева Н.В., Климко Н.Н. Криптококкоз легких у пациентки без ВИЧ-инфекции. Описание случая и обзор литературы // Проблемы медицинской микологии. — 2013. — Т. 15, № 2. — С. 18-24.

2. Васильева Н.В., Богомолова Т.С., Выборнова И.В., Босак И.А. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза. «Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». — 2007. — Т. 2. — С. 221.

3. Климко Н.Н. Микозы: диагностика и лечение, 2-е издание. — Москва, 2008. — С. 335.

4. Покровский В.В. ВИЧ-инфекция и СПИД. Клинические рекомендации, 2-е издание, перераб. и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. — 192 с. — С. 72.

5. Зубков М.Н. Сбор, транспортировка биологического материала и трактовка результатов микробиологических исследований. Лабораторная диагностика. — 2004. — Т. 6, № 2. — С. 143-154.

6. Аравийский Р.А., Климко Н.Н., Васильева Н.В. Диагностика микозов. — Санкт-Петербург: СПМАПО, 2004. — С. 185.

 

 

REFERENCES

1. Khostelidi S.N., Sorokina M.M., Borzova Yu.V., Chernopyatova R.M., Bogomolova T.S., Ignat’eva S.M., Frolova E.V., Filippova L.V., Avdeenko Yu.L., Bosak I.A., Tsinzerling V.A., Shurpitskaya O.A., Vasil’eva N.V., Klimko N.N. Pulmonary cryptococcosis in patients without HIV infection. A case report and review of the literature. Problemy meditsinskoy mikologii, 2013, vol. 15, no. 2, pp. 18-24 (in Russ.).

2. Vasil’eva N.V., Bogomolova T.S., Vybornova I.V., Bosak I.A. Faktory patogennosti Cryptococcus neoformans i ikh rol’ v patogeneze kriptokokkoza [Pathogenicity factors of Cryptococcus neoformans and their role in the pathogenesis of cryptococcosis]. Materialy IX s»ezda Vserossiyskogo nauchno-prakticheskogo obshchestva epidemiologov, mikrobiologov i parazitologov, 2007, vol. 2. P. 221.

3. Klimko N.N. Mikozy: diagnostika i lechenie, 2-e izdanie [Mycosis: diagnosis and treatment, 2nd edition]. Moscow, 2008. P. 335.

4. Pokrovskiy V.V. VICh-infektsiya i SPID. Klinicheskie rekomendatsii, 2-e izdanie, pererab. i dop. [HIV infection and AIDS. Clinical practice guidelines, 2nd edition, revised. and ext.]. Moscow: GEOTAR-Media, 2010. 192 p. P. 72.

5. Zubkov M.N. Sbor, transportirovka biologicheskogo materiala i traktovka rezul’tatov mikrobiologicheskikh issledovaniy. Laboratornaya diagnostika [Collection, transport of biological material and interpretation of the results of microbiological tests. Laboratory diagnosis], 2004, vol. 6, no. 2, pp. 143-154.

6. Araviyskiy R.A., Klimko N.N., Vasil’eva N.V. Diagnostika mikozov [Diagnosis of fungal infections]. Saint-Petersburg: SPMAPO, 2004. P. 185.