Поиск клинико-генетических ассоциаций при алкогольной болезни печени

Установлено, что повышенный риск развития желтушной формы алкогольного гепатита ассоциирован с комбинаций генотипов С1С1/del генов CYP2E1/GSTT1 и генотипов С1С1/CT генов CYP2E1/XRCC3. Тяжелое течение алкогольного гепатита, сопровождающееся печеночной энцефалопатией, встречается значительно чаще у носителей генотипов С1С1/GA генов CYP2E1/TNFA.

Clinical and genetic associations in alcoholic liver disease

It is established that an increased risk of icteric forms of alcoholic hepatitis is associated with combinations of genotypes C1C1/del genes CYP2E1/GSTT1 and genotypes C1C1/CT genes CYP2E1/XRCC3. Severe alcoholic hepatitis accompanied by hepatic encephalopathy, occurs much more frequently in carriers of genotypes C1C1/GA genes CYP2E1/TNFA.

Алкогольная болезнь является одной из наиболее актуальных в настоящее время проблем. Систематический прием алкоголя — повышенный фактор риска возникновения и тяжелого течения хронических заболеваний, а также одна из причин ранней инвалидизации молодого и наиболее трудоспособного населения [1]. Вместе с тем не у всех лиц, длительно употребляющих спиртные напитки, формируется болезнь, переносимость алкоголя индивидуальна. Накапливается все больше данных свидетельствующих о том, что возникновение алкогольной болезни печени (АБП) или характер ее течения ассоциирован с определенными генетическими факторами [2]. Работы, направленные на выявление корреляций полиморфных вариантов генов с характером развития патологии, являются особенно актуальными, в связи с возможностью применения маркеров для ранней диагностики болезней с наследственной предрасположенностью. В настоящее время проведены ассоциативные исследования генетического полиморфизма с хроническими гепатитами различной этиологии, включающими более 300 генов. Несмотря на опубликованные результаты многочисленных исследований, доказывающих роль генов в развитии гепатитов, в практической медицине эти сведения остаются мало учтенными. С возникновением идеи персонализированной медицины возникает необходимость выявлять клинико-генетические корреляции.

Цель настоящей работы — выявить у больных алкогольной болезнью печени ассоциаций полиморфных вариантов генов TNFA, GSTT1 и XRCC3 с клиническим течением.

Материал и методы

Методом случайного отбора в исследование были включены 163 человека с проявлениями алкогольной болезни печени (АБП) в возрасте 28-62 года (средний возраст 45,5±6,94 года), страдающих хроническим алкоголизмом более 8 лет и проходивших курс стационарной терапии в Республиканской психиатрической больнице №2, г. Уфы в 2009-2011 гг. Для диагностики использовались данные общего и биохимического анализа крови, ультразвукового исследования (УЗИ) печени. Высокий уровень общего сывороточного билирубина (22,9±10,68, за норму принимали 3,5-20 мкмоль/л) обнаружен у 28 (17,2%) обследованных. У 78 (47,8%) больных наблюдалась повышенная активность АсАТ — аспартатаминотрансферазы (48,8±13,16, норма — до 31 ЕД/л), у 83 (50,9%) — увеличенная активность АлАТ — аланинаминотрансферазы (51,5±8,18, норма — до 32 ЕД/л). Индекс де Ритиса (соотношение АСТ/АЛТ >2 считали показателем более тяжелого течения гепатита) был высоким (2,3±0,71) у 39 (23,9%) пациентов. В группу контроля (К) вошли 97 здоровых добровольца в возрасте 25-58 лет (средний возраст 41,3±8,71 года), отрицающих злоупотребление алкоголем. Все обследуемые — жители Республики Башкортостан (РБ). Отсутствие маркеров вирусных гепатитов являлось обязательным условием отбора в группы.

В качестве объекта исследования использовали образцы ДНК, полученные из периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции по Mathew [3]. Изучали рестрикционный полиморфизм (-1019)С/Т гена цитохрома Р-450 2Е1 — CYP2E1(pst1), (-308)G/A гена фактора некроза опухолей альфа — TNFA, полиморфизм (-18067) С/T (Thr241Met) гена репарации повреждений ДНК — XRCC3 (rs861539) методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов продуктов полимеразной цепной реакции синтеза ДНК [4, 5, 6] и делеционный полиморфизм гена глутатион-S—трансферазы Т1 — GSTT1 методом ПЦР [7].

Для статистического анализа использовали стандартные методы. Разницу в распределении частот генотипов и аллелей генов между группами рассчитывали с использованием критерия c2 с поправкой Йетса на непрерывность с помощью программы RxC-статистика (Roff, Bentzen; 1989). Статистически значимыми считали различия при р<0,05. Для количественной оценки относительного риска заболевания по конкретному аллелю или генотипу вычисляли показатель отношения шансов (odds ratio — OR). При OR=1 ассоциации нет, OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом, OR<1 — как отрицательную ассоциацию (Schlesselman, 1982).

Результаты и обсуждение

Клиническая картина алкогольной зависимости у обследуемых пациентов включала: патологическое влечение к алкоголю, изменение толерантности к спиртным напиткам, хронические соматические расстройства бронхолегочной, сердечно-сосудистой систем и желудочно-кишечного тракта, сформированный абстинентный синдром, социальную дезадаптацию. Среди сопутствующих и перенесенных заболеваний у пациентов чаще всего в анамнезе встречались: хронический бронхит — 47,1%, черепно-мозговая травма — 44,3%, хронический панкреатит — 28,5%, артериальная гипертензия — 17,8%, аритмия — 15,7%. Для обследуемых пациентов было характерно употребление большого количества спиртсодержащих напитков (в перерасчете на чистый этанол — более300 г).

Проведенный молекулярно-генетический анализ показал, что среди больных АБП носители генотипа С1С1 гена CYP2E1 составляли 96,9%, С1С2 — 1,2% и С2С2 — 1,9%, в контроле, соответственно, — 97,8, 1,1, 1,1. Статистические различия между группами АБП и контроля были незначительными (p>0,05). Учитывая малочисленность среди обследуемых лиц, носителей полиморфной аллели С2, из дальнейших исследований образцы ДНК с генотипами С1С2 и С2С2 были исключены.

Обследуемых больных АБП с генотипом С1С1 гена CYP2E1 (N=158) разделили на группы:

— с жировой дистрофией печени (стеатоз), у которых наблюдалось увеличение печени, при УЗИ выявлялась характерная гиперэхогенная структура паренхимы — 71 человек (44,9%);

— с желтушной формой алкогольного гепатита (ЖФ), сопровождающейся диспепсическими симптомами, желтухой, лейкоцитозом — 38 (24,1%);

— с холестатической формой (ХФ), сопровождающейся выраженным зудом, желтухой, обесцвечиванием кала, потемнением мочи, с высоким (более 20 мкмоль/л) уровнем билирубина и нерезким повышением активности аминотрансфераз сыворотки — 21 (13,3%);

— с признаками печеночной энцефалопатии (ПЭ), характеризующейся комплексом потенциально обратимых психических и неврологических нарушений (изменение сознания, поведения, снижение памяти, нарушения речи, тремора, полинейропатий и др.), с высоким (более 2) показателем соотношения АсАТ/АлАТ (индекс де Ритиса) — 28 (17,7%).

Сравнительный анализ делеционного полиморфизма гена второй фазы детоксикации ксенобиотиков GSTT1 показал, что лица с нулевым генотипом незначительно реже встречаются среди больных АБП, чем в контроле (28,0% против 25,3%; χ²=0.11; р=0.74). У больных стеатозом носители делеции составляли 12,9% — незначительно меньше чем в контроле (χ²=3.14; р=0.07); также в группах ХФ — 28,6% (χ²=0.00; р=0.97) и ПЭ — 42,9% (χ²=2.44; р=0.11). У больных желтушной формой алкогольного гепатита (АГ) делеция гена GSTT1 встречалась значительно чаще, чем в контроле (44,7% против 25,3%; χ²=3.95; р=0.04; OR=2.39; 95% CI: 1.01-5.68). Эти результаты согласуются с данными литературы, где показано, что комбинации гетерозиготного генотипа С1С2 гена CYP2E1 с делецией генов глутатион S—трансферазы класса Т1 и М1 часто встречаются при АБП [8]. Изучение характера распределения генотипов GSTT1 с учетом активности ферментов печени и уровня билирубина, достоверных отличий не выявило (p>0,05).

Анализ распределения частот генотипов полиморфного локуса (-308)G/A гена TNFA у носителей генотипа С1С1 гена CYP2E1 показал, что среди больных АБП носители генотипа GG составляли 51,3%; GА — 43,0% и АА — 5,7%; в контроле, соответственно, GG — 62,1; GА — 35,8; АА — 2,1. Различия между больными АБП и контроля были незначительными (p=0,12-0,31). У больных стеатозом носители генотипа GG составляли 54,9%; GА — 38,0%; АА — 7,0% и незначительно отличались от контроля (р=0,24-0,89); в группе ХФ соответственно — 57,1; 38,1; 4,8 (р=0,77-1,00); в группе ЖФ — 52,6; 42,1; 5,3 (р=0,34-0,68). У пациентов с ПЭ значительно реже, чем в контроле встречался генотип GG (35,7%; χ²=5.66; р=0.02; OR=0.32; 95% CI: 0.12-0.83) и чаще гетерозиготный генотип GA (60,7%; χ²=4.55; р=0.03; OR=2.77; 95% CI: 1.07-7.22). Высокий показатель отношения шансов позволяет считать, что генотип GA гена TNFA ассоциируется с более тяжелым течением АГ, сопровождающимся печеночной энцефалопатией. Полученные результаты согласуются с литературными данными о том, что транзиция G/A в -308 позиции промоторной области гена TNFA приводит к повышенной экспрессии гена, а присутствие аллеля А вдвое увеличивает продукцию цитокина по сравнению с аллелем G [5]. Известно, что в патогенезе АГ значительная роль отводится активности провоспалительных цитокинов, в том числе и фактора некроза опухолей альфа (TNFα) [9]. При повышении продукции TNF усиливаются процессы перекисного окисления и повреждение гепатоцитов. Развитие печеночной недостаточности увеличивает риск неблагоприятного течения сопутствующих заболеваний [1, 10]. На основании этих данных в клиническую практику были внедрены препараты с антицитокиновыми свойствами. Так, инфликсимаб (содержащий химерные антитела к TNFα), этанерсепт (блокирующий TNFα), пентоксифиллин (ингибитор продукции TNFα) продемонстрировали эффективность при АГ [9].

Проведен сравнительный анализ распределения частот генотипов полиморфного локуса (-18067) C/T гена XRCC3 у носителей генотипа С1С1 гена CYP2E1. Продукт гена XRCC3 (X–ray-repair cross-complementing) участвует в процессах пострепликативной репарации двухцепочечных разрывов ДНК и поддержании стабильности хромосом [11], такие повреждения являются наиболее генотоксичными. Установлено, что среди больных АГ носители генотипа СС составляли 52,9%; СТ — 29,9%; ТТ — 17,2%. В контроле, соответственно, — 43,7; 48,3; 8,0. Различия между частотой генотипов СС и ТТ у больных АГ и контроля были незначительными (p=0,11-0,29). Установлено, что в группе АГ генотип СТ встречался значительно реже, чем в контроле (χ²=5.43; р=0.02; OR=0.45; 95% CI: 0.23-0.89). В группе ХФ генотип СС составлял — 42,9%; СТ — 47,6%; ТТ — 9,5% (р=1,00-0,00). В группе ЖФ, соответственно, 52,6% (p=0,46); СТ — 26,3% (χ²=4.39; р=0.04; OR=0.38; 95% CI: 0.15-0.95); ТТ — 21,1% (p=0,07). У пациентов с ПЭ, соответственно, — 60,7 (p=0,18); 21,4 (χ²=5.22; р=0.02; OR=0.29; 95% CI: 0.09-0.86); 17,9 (p=0,26). Статистический анализ показал, что генотип СТ гена XRCC3 значительно реже, чем в контроле, встречался в группах ЖФ (р=0.04) и ПЭ (р=0.02). Полученные результаты могут свидетельствовать о неслучайной элиминации генотипа СТ гена XRCC3 у больных АГ. Причиной снижения частоты СТ в группах ЖФ и ПЭ (длительно злоупотребляющих алкоголем) возможно связано с тем, что носители этого генотипа ранее отсеивались из-за скорого развития у них тяжелого течения АГ и цирроза печени.

При анализе сочетания генотипов С1С1/CT/del генов CYP2E1/XRCC3/GSTT1 и С1С1/CT/GA генов CYP2E1/XRCC3/TNFA статистически значимых отличий не выявлено (табл. 1).

Таблица 1.

Комбинации генотипов повышенного риска полиморфных локусов генов у лиц с алкогольным гепатитом и контроля

Выводы

1. Выявлены ассоциации комбинации генотипов С1С1/del генов CYP2E1/GSTT1, генотипов С1С1/CT генов CYP2E1/XRCC3 с развитием желтушной формы алкогольного гепатита.

2. Установлено, что при тяжелом течении алкогольного генотипа, сопровождающегося печеночной энцефалопатией, чаще встречается комбинация генотипов С1С1/GA генов CYP2E1/TNFA.

Л.И. Лукманова, Р.А. Давлетшин, В.Л. Юлдашев, А.Р. Асадуллин,Т.В. Викторова

Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН

Лукманова Лима Ильгизовна — аспирант Института биохимии и генетики

 Литература:

1. Козлова И.В., Сущенко М.А. Клинико-морфологические особенности патологии гастродуоденальной зоны при алкогольной болезни печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. — 2010. — № 5. — С. 33-38.

2. Гончарова И.А., Гамаль АБД Ель-Азиз Наср, Белобородова Е.В. и др. Полиморфизм генов модификаторов иммунного ответа при заболеваниях печени различной этиологии // Мед. генетика. — 2010. — № 12. — С. 20-24.

3. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA
// Methods in Molecular Biology / Ed. J.M. Walker. — New York., London. — 1984. — Vol. 2. — P. 31-34.

4. Thier R., Lewalter J., Selinski S., Bolt H.M. Possible impact of human CYP2E1 polymorphisms on the metabolism of acrylonitrile // Toxicol. Lett. — 2002. — V. 128, № 1-3. — P. 249-55.

5. Wilson A.G., Symon J.A., McDowel T.L. et al. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor alpha promoter on transcriptional activation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1997. — Vol. 94. — P. 3195-3199.

6. Cima M.F., Arriaga P.G., García-Castro L., et al. Polymorphisms in XPC, XPD, XRCC1, and XRCC3 DNA repair genes and lung cancer risk in a population of Northern Spain // BMC Cancer. — 2007. — Vol. 7. — P. 162.

7. El-Zein R., Zwischenberger J.B., Wood T.G., Abdel-Rahman S.Z., Brekelbaum C., Au W.W. Combined genetic polymorphism and risk for development of lung cancer // Mutat. Res. — 1997. — V. 381, № 2. — P. 189-200.

8. Шангареева З.А. полиморфизм ДНК-локусов генов-кандидатов алкогольной болезни печени: автореф. дис. … канд. мед. наук: 03.00.04 — Уфа. — 2004. — 22 с.

9. Буеверов А.О., Павлов А.И., Ивашкин В.Т. Алкогольная болезнь печени: возможно ли улучшение прогноза? // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. — 2011. — № 2. — С. 3-10.

10. Нартайлаков М.А., Гвоздик Т.П., Ткаченко В.Н., Кононов В.С. Коррекция печеночной недостаточности в комплексном лечении больных с инфицированным панкреонекрозом // Медицинский вестник Башкортостана. — 2010. — Т. 5, № 5. — С. 6-10.

11. Manuguerra M., Saletta F., Karagas M.R., Berwick M. et al. XRCC3 and XPD/ERCC2 single nucleotide polymorphisms and the risk of cancer: HuGE review // American J. Of epidemiology. — 2006. — Vol. 164, № 4. — P. 297-302.