Пространственная динамика свертывания крови на модели механического повреждения сосуда: фундаментальные механизмы регуляции и методы диагностики и терапии в кардиологии


В последние десятилетия в кардиологических исследованиях большое внимание уделяется изучению плазменного гемостаза крови и методов диагностики его нарушений. Исследование системы свертывания крови — одна из самых сложных и актуальных задач современной медицины. Поскольку образование сгустка при различной патологии идет несколькими путями и трудно поддается диагностике, авторами предложено анализировать процесс свертывания с помощью прибора для регистрации пространственной динамики тромбообразования, который позволяет наблюдать различные коагуляционные состояния.

Spatial dynamics of blood coagulation on a model of mechanical damage the vessel: basic regulatory mechanisms and methods of diagnosis and treatment in cardiology

In recent decades, cardiology research focuses on the study of plasma hemostasis and diagnostics of the violation. The study of the blood coagulation system is one of the most complex and actual problems of modern medicine. Since the formation of a clot in the pathology is different ways and is difficult to diagnosis, the authors proposed to analyze the coagulation process using the device for recording the spatial dynamics of blood clots, which allows us to observe the different coagulation status.

Система гемостаза, отвечающая за остановку кровотечения при повреждении сосудистой системы, одна из жизненно важных и в то же время наиболее уязвимых систем человеческого организма [1-3]. Большое число нарушений гемостаза обусловлено наследственно. Кроме того, самые разные заболевания и состояния, начиная от травм любого рода и заканчивая онкологическими заболеваниями и сепсисом, часто ведут к опасным нарушениям гемостаза, которые угрожают тромбозами, кровотечениями или внутренними кровоизлияниями. Таким образом, изменения в системе гемостаза оказываются непосредственной причиной смертности или инвалидности в многочисленных случаях, когда заболевание не связано изначально с нарушением работы системы свертывания. В России и США тромбозы ежегодно являются причиной нескольких сотен тысяч смертей [4]. Данная статья посвящена одному из перспективных направлений в этой области, важному для кардиологии и связанному с регуляцией пространственной динамики свертывания крови как центрального звена системы гемостаза. В настоящее время это направление, зародившееся около 20 лет назад, привело не только к пересмотру традиционных представлений о каскаде свертывания крови [5], но и к практически значимым медицинским разработкам в кардиологии.

Свертывание крови

Наиболее существенные реакции системы свертывания крови представлены на рис. 1 [6, 7]. Запускающим сигналом для свертывания служит повреждение кровеносного сосуда. Клетки практически всех тканей организма, за исключениям эндотелия и клеток крови, экспрессируют особый трансмембранный белок — тканевый фактор. Поэтому в норме тканевый фактор не контактирует с кровью. Однако любое повреждение эндотелия приводит к тому, что плазма крови вступает в контакт с клетками, несущими тканевый фактор. В плазме постоянно присутствует фактор VIIa — сериновая протеаза, которая сама по себе почти не обладает ферментативной активностью. Однако, когда фактор VIIa связывается с тканевым фактором, получившийся комплекс внешней теназы приобретает мощную ферментативную активность и способность активировать факторы IX и X. Эти события и запускают процесс свертывания крови.


Каскад реакций свертывания крови состоит из сериновых протеиназ. Эти трипсин-подобные белки способны активировать друг друга путем специфического расщепления в определенных местах. В результате активации неактивные факторы приобретают ферментативную активность. Как видно из рис. 1, система свертывания крови обладает сложной регуляцией. Последним и главным ферментом в каскаде является тромбин.

Рисунок 1. Основные реакции свертывания крови. 

Пространственная динамика свертывания крови на модели механического повреждения сосуда: фундаментальные механизмы регуляции и методы диагностики и терапии в кардиологии

Реакции активации факторов свертывания показаны односторонними тонкими черными стрелками; при этом фигурные стрелки показывают, под действием каких именно ферментов происходит эта активация. Обратимые реакции формирования комплексов показаны двусторонними тонкими черными стрелками. Ингибирование показано короткими белыми стрелками. Чтобы избежать перегруженности, на схеме не показаны: контактная активация свертывания, активация и секреция тромбоцитов, связывание тромбина с тромбомодулином. Адаптировано из [16].


 

 

Сами по себе реакции активации фактора X фактором IXa и протромбина (фактор II) фактором Xa протекают очень медленно. Однако небольшие количества тромбина, полученные в этих реакциях, запускают петли положительных обратных связей, приводящие к взрывному образованию тромбина. В первую очередь тромбин увеличивает количество внешней теназы путем активации фактора VII в фактор VIIa. Во-вторых, тромбин активирует факторы VIII и V. Их активные формы являются кофакторами для факторов IXa и Xa соответственно. Тромбин также активирует тромбоциты, что приводит к формированию комплексов IXa-VIIIa (внутренняя теназа) и Xa-Va (протромбиназа) на их мембранах. Эти комплексы, собирающиеся в присутствии ионов кальция, способны работать на 3-5 порядков быстрее, чем ферменты в отсутствие кофакторов.

Кроме того, тромбин в присутствии активированных тромбоцитов активирует фактор XI, который способен в свою очередь активировать фактор IX. Тромбин принимает участие также в ингибировании свертывания через путь протеина С. Активированный тромбином (в комплексе с трансмембранным белком тромбомодулином, который присутствует в мембранах эндотелиальных клеток и связывает тромбин) протеин С расщепляет и ингибирует факторы Va и в меньшей степени VIIIa, что приводит к «выключению» комплексов внутренней теназы и протромбиназы.

Все активные ферменты системы ингибируются присутствующими в плазме ингибиторами протеаз, основными из которых являются антитромбин III (AT-III) и ингибитор пути тканевого фактора (TFPI). Aнтитромбин III — главный ингибитор тромбина, тогда как TFPI ингибирует внешнюю теназу по сложному Xa-зависимому механизму. Кроме AT-III и TFPI, в ингибировании факторов свертывания крови в разной степени участвуют альфа2-макроглобулин, альфа1-антитрипсин, альфа2-антиплазмин, кофактор гепарина II, ингибитор протеина C, C1-ингибитор и др. В дополнение к индукции тканевым фактором, свертывание может быть активировано контактным путем, который запускается при контакте плазмы с отрицательно заряженными чужеродными поверхностями (этот путь на схеме не показан). В этом пути работают фактор XII, прекалликреин и высокомолекулярный кининоген. Фактор XII связывается с чужеродной поверхностью, что приводит к изменению его конформации и запуску сети реакций контактного пути. На выходе этой системы происходит активация фактора XI. На настоящий момент роль этого пути в свертывании крови не выяснена. Общепринятым является мнение, что этот путь не работает в нормальном гемостазе, так как люди с дефицитами факторов контактной фазы не склонны к кровоточивости.

Тромбин осуществляет превращение белка фибриногена в фибрин, который полимеризуется, что приводит к формированию фибриновой сети и переводу крови из жидкого состояния в желеобразное. Превращение фибриногена в фибрин протекает в несколько стадий. На первом этапе тромбин действует на N-концевые участки цепей фибриногена, отделяя от этих концов по две молекулы фибринопептидов А и В. В результате фибриноген преобразуется в фибрин-мономер, в центре молекулы которого имеется реакционная поверхность с измененным отрицательным зарядом. Эта поверхность взаимодействует с комплементарными поверхностями на N-концах других молекул фибрин-мономера, что приводит к спонтанной агрегации фибрин-мономеров (второй этап). При этом фибрин-мономеры оказываются соединены между собой посредством гидрофобных, ионных и водородных взаимодействий. На третьем этапе под влиянием фактора XIIIa, активированного тромбином, этот растворимый фибрин-полимер превращается в нерастворимый фибрин. Фактор XIIIa, в отличие от прочих факторов свертывания крови, является трансглутаминазой, которая катализирует образование пептидной связи между глутамином и лизином через последовательные aцилирование и деацилирование. Эта реакция высокоспецифична и осуществляется только между отдельными лизиновыми и глутаминовыми остатками фибрина и некоторых других белков. После стабилизации трансглутаминазой многократно повышается устойчивость сгустка к действию химических растворителей и системы фибринолиза. Однако структура сгустка (размер волокон, ячеек сети) практически не зависит от присутствия или отсутствия фактора XIIIa. Волокна фибрина укрепляют и фиксируют в месте повреждения сосуда первичный тромбоцитарный сгусток, препятствуя его размыванию кровотоком. Более подробное рассмотрение плазменного гемостаза можно найти в специализированных руководствах [1-3, 6].

Пространственная регуляция свертывания крови

Классические тесты свертывающей системы крови, например, тест активированного частичного тромбопластинового времени [1], выполняются в пробирке с перемешиванием. Процессы распространения тромба или гемостатического сгустка в пространстве при этом не учитываются. Между тем, если посмотреть на схему реакций свертывания, заметно, что разные реакции этой схемы происходят в различных ее участках [5]: связанные с тканевым фактором реакции активации — на поврежденном участке сосуда, связанные с протеином С реакции ингибирования — на здоровом эндотелии, катализируемые внутренней теназой и протромбиназой реакции — на поверхности активированных тромбоцитов, большинство оставшихся — в плазме крови. Свертывание крови сложно сводить к единой и двумерной биохимической схемы, так как его части разнесены в пространстве, и белки могут попадать из одного участка в другой только с помощью диффузии или переноса потоком крови. Более того, сама задача свертывания (создать сгусток, строго локализованный в месте повреждения) является задачей пространственной. Поэтому процессы транспорта и учет пространственной неоднородности оказываются для свертывания критически важными. Привнесение пространственных соображений в плазменный гемостаз приводит к существенному пересмотру представлений о его регуляции.

Попытки учесть роль диффузии в регуляции свертывания в разное время предпринимались разными исследователями [7], но наиболее явно и полно этот вопрос был исследован в работах нашей лаборатории [8-19]. Еще в 1990-х годах нами были созданы первые математические модели и экспериментальные системы, где исследовалось формирование фибринового сгустка в пространственно неоднородных системах по регистрации светорассеяния от сгустка, выращенного в неперемешиваемой плазме. Свертывание происходило в специальной кювете, одна из стенок которой представляла собой активатор. С помощью этой установки нами была выполнена серия исследований, позволивших выявить механизмы нарушения тромбообразования при гемофилиях [12-14]. Типичные фотографии растущего сгустка в плазмах больных, дефицитных по различным факторам свертывания представлены на рис. 2А. Инициация свертывания в плазме больного гемофилией А происходила нормально, в то время как распространение процесса вглубь плазмы было сильно нарушено, скорость пространственного роста сгустка была в 3-4 раза меньше, чем в норме. При дефиците фактора XI различия были меньше и проявлялись на более поздних этапах, что согласуется с менее тяжелыми кровотечениями, наблюдаемыми при гемофилии С.

Рисунок 2. Пространственная регуляция свертывания крови.

 

Пространственная динамика свертывания крови на модели механического повреждения сосуда: фундаментальные механизмы регуляции и методы диагностики и терапии в кардиологии

 

 

Пространственная динамика свертывания крови на модели механического повреждения сосуда: фундаментальные механизмы регуляции и методы диагностики и терапии в кардиологии

 

(А) Влияние дефицитов индивидуальных факторов свертывания на пространственную динамику роста фибринового сгустка in vitro. Фотографии сгустка, формирующегося в плазмах пациентов, дефицитных по указанным факторам свертывания. Активация монослоем макрофагов. Полоса масштаба: 1 мм. Воспроизведено из [14]. 

 (Б) Схематическое представление пространственной концепции регуляции свертывания. Свертывание активируется клетками, экспрессирующими тканевый фактор (слева), и распространяется вглубь плазмы. Генерация тромбина регулируется фактором Xa, лимитирующим компонентом протромбиназы. Свертывание около активатора (фаза инициации) определяется исключительно производством фактора Xa внешней теназой. Однако фактор Xa быстро ингибируется и не может диффундировать далеко от активатора. Поэтому в фазе распространения сгустка он образуется внутренней теназой. Однако лимитирующий компонент внутренней теназы, фактор IXa, производится внешней теназой. В отличие от Xa он ингибируется слабо и диффундирует далеко. При дальнейшем удлинении сгустка дополнительный фактор IXa производится фактором XIa в петле положительной обратной связи. Наконец, формирование сгустка останавливается вследствие действия тромбомодулина: петля отрицательной обратной связи активирует протеин С, который останавливает распространение тромбина, разрушая факторы Va и VIIIa. Адаптировано из [16].

Эти результаты продемонстрировали роль пространственной неоднородности в регуляции свертывания. Они показали, что внутренняя и внешняя теназа не просто дополняют друг друга, а работают в различных областях пространства и в разных стадиях процесса тромбообразования. Как и следовало ожидать, возле активатора внешняя теназа производит достаточное количество фактора Xa, чтобы свертывание прошло до конца. Однако, диффузия этого фактора недостаточно эффективна, и поэтому вдали от активатора фактор X активируется внутренней теназой, которая, таким образом, контролирует распространение процесса свертывания. Эти результаты указывают, что факторы IXa и Xa играют разные роли в свертывании: фактор Xa, сделанный внешней теназой, требуется для запуска свертывания, но не может добраться до тромбоцитов, чтобы сформировать протромбиназу из-за его ингибирования в плазме. Напротив, фактор IXa ингибируется медленно, может диффундировать к тромбоцитам и производить там фактор Xa; дополнительный фактор IXa делается прямо на тромбоцитах фактором XIa [16].

Одним из наиболее важных элементов гемостаза, отсутствующих в данной экспериментальной постановке, являются эндотелиальные клетки, экспрессирующие антикоагулянты, в т.ч. тромбомодулин. Чтобы имитировать эффект эндотелия, мы провели эксперименты с добавлением тромбомодулина в систему и обнаружили, что это действительно ведет к остановке роста сгустка [16]. Несмотря на то, что в течение некоторого времени тромбомодулин является предполагаемым участником локализации тромбообразования, в этой работе его прямое воздействие на остановку роста тромба было показано впервые. Эти данные согласуются с исследованиями in vivo, показавшими, что наследственный дефицит тромбомодулина сокращает время окклюзии и увеличивает число случаев полной окклюзии в FeCl3-индуцированного тромбоза у мышей.

Диагностика и терапия нарушений свертывания: современные перспективы

Несовершенство существующих методов диагностики свертывания, их низкая чувствительность и неспецифичность, неоднократно отмечались в профессиональной литературе [2, 4, 21]. В настоящий момент создаются и испытываются улучшенные варианты классических тестов гемостаза [22], а также ряд полностью оригинальных подходов [2]. Тем не менее подавляющее большинство этих подходов отличаются одним общим недостатком, отсутствием пространственной неоднородности: активатор полностью перемешивается с образцом. В результате естественные фазы развития процесса тромбообразования нарушаются, а сильная активация свертывания во всем объеме образца препятствует детекции гиперкоагуляционных изменений в крови, которые могут вносить существенный вклад in vivo именно из-за того, что in vivo такой искусственной, внешней активации по объему нет.

На базе научно-исследовательской установки для регистрации пространственной динамики роста сгустка [13-16, 20] в лаборатории Гематологического научного центра [23, 24] был разработан прототип прибора для диагностики нарушений гемостаза (рис. 3А).

Рисунок 3. Пространственная динамика формирования фибринового сгустка in vitro в норме и при патологии. 

Пространственная динамика свертывания крови на модели механического повреждения сосуда: фундаментальные механизмы регуляции и методы диагностики и терапии в кардиологии

(А)Принципиальная схема прибора для регистрации пространственной динамики тромбообразования. Плазма помещается в вертикально расположенную кювету с прозрачной стенкой, находящуюся в водяном термостате. Сверху кювета закрывается вставкой, несущей на передней грани активатор — иммобилизованный тканевый фактор. От активатора вглубь плазмы начинает расти фибриновый сгусток, который регистрируется видеокамерой по светорассеянию. Адаптировано из [2]. 

(Б) Фотографии растущего сгустка в норме и при патологии в различные моменты времени. Условия измерения указаны на панели.

Принцип его действия заключается в активации свертывания в неперемешиваемой плазме слоем иммобилизованного тканевого фактора. Растущий сгусток освещается красным светом и регистрируется цифровой камерой по светорассеянию методом темного поля. Метод включает в себя ряд нововведений, начиная от стабилизации pH плазмы и заканчивая добавлением ингибитора контактной активации для предотвращения артефактной активации от стенок кюветы. Однако наиболее радикальным и принципиальным нововведением является пространственная неоднородность и локализация активации свертывания. Благодаря этому можно наблюдать несколько различных фаз свертывания. Первая фаза, процесс запуска системы и формирование начального сгустка около активатора, наиболее близка по смыслу к классическим тестам свертывания. Время появления сгустка у активатора, лаг-период, хорошо коррелирует с ними. Затем сгусток начинает распространяться в пространстве и именно эта фаза процесса оказывается уникальной. В крови при определенной патологии — сепсисе, воспалении, онкологических заболеваниях — могут циркулировать тканевый фактор, активные факторы свертывания, тромбоцитарные микровезикулы; неоднородность активации делает метод чувствительным к этим изменениям [16, 24, 25, 27]. Склонность к кровоточивости при гемофилии также детектируется изменениями в этой фазе [16, 24, 25, 27].

На рис. 3Б представлены фотографии, иллюстрирующие возможность наблюдения гиперкоагуляционных изменений в плазме пациентов, имеющих патологию, часто сопровождаемую тромбозами (в ряде случаев они были обнаружены у данных пациентов). Скорость роста сгустка у пациентов заметно увеличена и в дополнение к обычному тромбу появляются не зависящие от активатора сгустки в объеме плазмы, между тем как значения стандартных тестов свертывания лежат в пределах нормы.

Учет пространственной неоднородности приводит также к пересмотру механизмов действия лекарственных препаратов. Так, нами было проведено исследование действия препарата «Новосевен» (рекомбинантный активированный фактор VIIa) при гемофилии [15] с помощью созданной нами установки и обнаружено, что предпочтительный механизм его действия зависит от распределения и концентрации активатора в системе.

Выявление связей между нарушениями функций отдельных молекул и патологиями, наблюдаемыми на уровне всей системы, показывает, что каждая стадия свертывания контролируется своей реакцией: инициация — группой реакций внешнего пути, пространственное формирование сгустка — положительными обратными связями с участием факторов VIII и XI, остановка — путем протеина С.

Это позволяет предложить методы лечения, направленные на коррекцию именно этой стадии и оставляющие другие этапы неизменными. Например, можно предположить, что тромбомодулин будет ингибировать распространение свертывания, но не его инициацию. Это позволит избежать тромбообразования и при этом не нарушить нормальный гемостаз. С другой стороны, петля обратной связи через фактор XI, обеспечивающая неограниченное распространение сгустка, может быть ингибирована с той же целью. Уже в настоящий момент множество лекарственных препаратов, направленных на «точечные воздействия» в системе свертывания находится в состоянии разработки и тестирования: рекомбинантный тромбомодулин (Solulin), TFPI, ингибиторы фосфолипидных поверхностей (препятствующие сборке комплексов теназы и протромбиназы) и другие. Можно ожидать, что развитие и применение таких подходов будет лидирующим направлением в регистрации и диагностике патологий системы гемостаза в ближайшие годы.

Работа авторов поддержана грантами РФФИ 10-01-91055, 11-04-00303, 11 04 12080, 12-04-00652-а, 12-04-00438-а, 12-04-00111-а и программами фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», «Фундаментальные науки — медицине», «Интегративная физиология» и «Молекулярные механизмы физиологических функций». Авторы выражают благодарность Н.П. Сошитовой, И.И. Серебрийскому, А.Ю. Храмовой и Э.Т. Зиннатуллиной за обсуждение и помощь.

 

Р.И. Шакирова, М.А. Пантелеев, А.Н. Дойникова, Р.И. Жданов, Ф.И. Атауллаханов 

Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, г. Москва

Институт фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета

Гематологический научный центр МЗ СР РФ

ООО «ГемаКор», г. Москва 

Шакирова Регина Ильгизовна — аспирант кафедры биохимии КФУ


Литература:

1. Исследование системы крови в клинической практике / под ред. Г.И. Козинца и В.А. Макарова. — Москва: Триада-Х, 1997.

2. Пантелеев М.А., Васильев С.А., Синауридзе Е.И. и др. Практическая коагулология. — Москва: Практическая медицина, 2010.

3. Colman R.W. Hemostasis and thrombosis basic principles and clinical practice. Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2006.

4. Савельев В.С., Кириенко А.И. Российские медицинские вести, 2007.

5. Panteleev M.A., Balandina A.N., Lipets E.N. et al. Task-oriented modular decomposition of biological networks: trigger mechanism in blood coagulation. Biophys J 2010; 98: 1751-1761.

6. Michelson A.D. Platelets. Amsterdam: Academic Press/Elsevier, 2007.

7. Hathcock J.J., Nemerson Y. Platelet deposition inhibits tissue factor activity: in vitro clots are impermeable to factor Xa. Blood, 2004; 104: 123-127.

8. Атауллаханов Ф.И., Волкова Р.И., Гурия Г.Т. и др. Пространственные аспекты свертывания крови. III. Рост сгустков in vitro. Биофизика, 1995; 40: 1320-13.

9. Ataullakhanov F.I., Guria G.T., Sarbash V.I. et al. Spatiotemporal dynamics of clotting and pattern formation in human blood. Biochim Biophys Acta 1998; 1425: 453-468.

10. Balandina A.N., Shibeko A.M., Kireev D.A. et al. Positive feedback loops for factor V and factor VII activation supply sensitivity to local surface tissue factor density during blood coagulation. Biophys J 2011; 101: 1816-1824.

11. Fadeeva O.A., Panteleev M.A., Karamzin S.S. et al. Thromboplastin immobilized on polystyrene surface exhibits kinetic characteristics close to those for the native protein and activates in vitro blood coagulation similarly to thromboplastin on fibroblasts. Biochemistry (Mosc) 2010; 75: 734-743.

12. Ovanesov M.V., Krasotkina J.V., Ul’yanova L.I. et al. Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Biochim Biophys Acta 2002; 1572: 45-57.

13. Ovanesov M.V., Lopatina E.G., Saenko E.L. et al. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Thromb Haemost 2003; 89: 235-242.

14. Ovanesov M.V., Ananyeva N.M., Panteleev M.A. et al. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth rate. J Thromb Haemost 2005; 3: 321-331.

15. Ovanesov M.V., Panteleev M.A., Sinauridze E.I. et al. Mechanisms of action of recombinant activated factor VII in the context of tissue factor concentration and distribution. Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19: 743-755.

16. Panteleev M.A., Ovanesov M.V., Kireev D.A. et al. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein C pathways, respectively. Biophys J, 2006; 90: 1489-1500.

17. Parunov L.A., Fadeeva O.A., Balandina, A.N. et al. Improvement of spatial fibrin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation. J Thromb Haemost, 2011; 9: 1825-1834.

18. Shibeko A.M., Lobanova E.S., Panteleev M.A. et al. Blood flow controls coagulation onset via the positive feedback of factor VII activation by factor Xa. BMC Syst Biol 2010; 4: 5.

19. Sinauridze E.I., Kireev D.A., Popenko N.Y. et al. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets. Thromb Haemost ,2007; 97: 425-434.

20. Hemker H.C., Dieri R., Beguin S. Thrombin generation assays: accruing clinical relevance. Curr Opin Hematol 2004; 11: 170-175.

21. Toh C.H., Samis J., Downey C. et al. Biphasic transmittance waveform in the APTT coagulation assay is due to the formation of a Ca (2+)-dependent complex of C-reactive protein with very-low-density lipoprotein and is a novel marker of impending disseminated intravascular coagulation. Blood 2002; 100: 2522-2529.

22. Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Свертывание крови: методы исследования и механизмы регуляции. — Клиническая онкогематология, 2008; 1: 174-181.

23. Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Mathematical modeling and computer simulation in blood coagulation. Pathophysiol Haemost Thromb, 2005; 34: 60-70.

24. Denas G., Pengo V. Current anticoagulant safety. Expert Opin Drug Saf 2012; 11: 401-413.

25. Favaloro E.J., Lippi G. Coagulation update: what’s new in hemostasis testing? Thromb Res 2011; 127 Suppl 2: S13-S16.

26. Panteleev M.A., Ananyeva N.M., Ataullakhanov F.I. et al. Mathematical models of blood coagulation and platelet adhesion: clinical applications. Curr Pharm Des 2007; 13: 1457-1467.

27. Orfeo T., Butenas S., Brummel-Ziedins K.E. et al. Anticoagulation by factor Xa inhibitors. J Thromb Haemost 2010; 8: 1745-1753.

28. Tucker E.I., Marzec U.M., White T.C. et al. Prevention of vascular graft occlusion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI. Blood, 2009; 113: 936-944.

29. Shibeko A.M., Woodle S.A., Lee T.K. et al. Unifying the mechanism of recombinant FVIIa action: dose-dependence is regulated differently by tissue factor and phospholipids. Blood, 2012.

30. Xu Z., Kamocka M., Alber M. et al. Computational approaches to studying thrombus development. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2011; 31: 500-505.