Ю.В. МАРКИТАНТОВА, Н.В. ФИРСОВА, Ю.А. СМИРНОВА, И.Г. ПАНОВА, Г.Т. CУХИХ, Р.Д. ЗИНОВЬЕВА
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва
НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии МЗ РФ, г. Москва
Маркитантова Юлия Владимировна
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Проведено сравнительное исследование динамики экспрессии регуляторных факторов PAX6, TGFbeta2, PITX2, FOXC1 в сетчатке и пигментном эпителии глаза в пренатальном периоде развития человека. Показано участие этих регуляторных факторов в гистогенезе сетчатки. В иммунохимическом исследовании локализации соответствующих белков выявлена корреляция между экспрессией изучаемых регуляторных факторов и дифференцировкой ганглиозных клеток сетчатки.
Ключевые слова: сетчатка, пигментный эпителий, эмбриогенез, трансформирующий фактор роста TGFbeta2, транскрипционные факторы PAX6, PITX2, FOXC1.
YU.V. MARKITANTOVA, N.V. PHIRSOVA, YU.A. SMIRNOVA, I.G.PANOVA, G.T. SUKHIKH, R.D. ZINOVEVA
Institute of Developmental Biology named after N.K. Koltsov of the Russian Academy of Sciences, Moscow
Research Center of Obstetrics, Gynecology and Perinatology of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow
Regulator factors in the control of retina formation and retinal pigment epithelium in human embryogenesis
The comparative study of the dynamics expression of regulatory factors PAX6, TGFbeta2, PITX2, FOXC1 in retina and retinal pigment epithelial during prenatal human development was performed. The involvement of these regulatory factors in the human retina histogenesis was shown. After immunochemical study of the corresponding proteins localization was found a correlation between the expression of the regulator factors studied and the differentiation of retinal ganglion cells.
Keywords: retina, pigment epithelium, embryogenesis, transforming growth factor TGFbeta2, transcription factors PAX6, PITX2, FOXC1.
Молекулярно—генетические механизмы развития и функционирования глаза человека представляют огромный интерес для биомедицины. В контроле морфогенеза глаза важное место занимают межклеточные взаимодействия и регуляторные гены, обеспечивающие правильное формирование всех тканей глаза [1]. Нарушения экспрессии регуляторных генов в ходе эмбриогенеза приводят к врожденным аномалиям развития глаза, негативно отражаясь на зрительной функции, и даже могут приводить к полному отсутствию глаз [2-4]. Некоторая патология глаза (глаукома, пигментный ретинит и др.) затрагивает в той или иной степени гистогенез и структуру составляющих его тканей и приводит к ретинопатии. В связи с этим изучение молекулярно-генетических механизмов формирования тканей глаза в эмбриональном развитии человека не теряет своей актуальности. В настоящей работе мы исследовали экспрессию регуляторных генов, принадлежащих к «генам глазного поля»: сигнального белка TGFbeta2 и транскрипционных факторов PITX2, FOXC1, PAX6 в ходе развития сетчатки и пигментного эпителия, важных составляющих глаза человека. Интерес к транскрипционному фактору PAX6/Pax6 обусловлен тем, что он находятся в числе основных регуляторов морфогенеза глаза позвоночных [5]. Мультифункциональный сигнальный белок TGFbeta, выполняет функцию ингибитора пролиферации, участвует в регуляции пролиферации, апоптоза, дифференцировки клеток глаза [6, 7]. Регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2/Pitx2 и FOXC1/Foxc1 контролируют в составе общего сигнального пути морфогенез переднего сегмента глаза позвоночных в эмбриональном развитии и вовлечены в патогенез глаукомы [8, 9].
Цель работы состояла в детальном сравнительном исследовании динамики экспрессии генов TGFbeta2, PITX2, FOXC1, PAX6 и их белковых продуктов в сетчатке и ретинальном пигментном эпителии человека в пренатальном развитии человека.
Материал и методы
В настоящем исследовании охвачен пренатальный период развития человека, с 9.5 до 22-й нед. гестации. Абортивный материал получали из лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательства РФ об охране здоровья граждан, в соответствии с утвержденным перечнем медицинских показаний. Возраст плодов соответствует срокам, установленным врачом-акушером. Для оценки распределения мРНК исследуемых генов были использованы молекулярно—биологические методы (обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция, ОТ—ПЦР). Тотальную РНК выделяли из изолированных сетчатки и пигментного эпителия с помощью TRI® Reagent (Sigma, США). Другие ткани глаза в данной работе не анализировали. Синтезировали кДНК—библиотеки из тканей, взятых с разных стадий развития глаза, проводили ПЦР с использованием набора реактивов для амплификации (Силекс М, Россия). кДНК—библиотеки нормировали по уровню экспрессии гена, кодирующего рибосомальный белок RPL19. Белки локализовали на криосрезах глаза методом флуоресцентной иммунохимии. Использовали антитела к TGFbeta2 (Abcam, Англия, 1:20), PITX2 (Sigma, США, 1:200), PAX6 (Abcam, Англия, 1:200), FOXC1 (Abcam, Англия, 1:180) и вторичные антитела, конъюгированные с флуорохромами Aleksa 488 или Aleksa 546 (Molecular Probes, США, 1:1000). Срезы заключали в среду Vectashield (Vector, США). Отрицательным контролем служила реакция без первичных антител. Иммунореакцию анализировали с помощью микроскопа DM RXA2 (Leica, Германия), программ Leica for Windows, ImageJ.
Результаты
Методом ПЦР мы обнаружили мРНК TGFbeta2, PITX2, FOXC1 и PAX6 в сетчатке и пигментном эпителии глаза человека 9.5, 11, 13-14, 17-18 и 21-22 нед. гестации. Методом иммунохимии белки PITX2, FOXC1 были локализованы во внутреннем и наружном нейробластических слоях сетчатки 9.5 недели, ранней из анализируемых стадий гестации. Во внутреннем витреальном слое сетчатки PITX2 и FOXC1 были выявлены в ядрах дифференцирующихся ганглиозных клеток центральной области сетчатки. Известно, что в ходе гистогенеза сетчатки дифференцировка клеток распространяется от центра к периферии, а ганглиозные клетки начинают дифференцироваться первыми [10]. Локализация белка TGFbeta2 на 9.5 нед. развития имеет сходные черты: TGFbeta2 выявлен во внутреннем безъядерном слое сетчатки, образованным отростками формирующихся ганглиозных клеток и клеток глии Мюллера. На 9.5 нед. белки PITX2, FOXC1, TGFbeta2 также обнаружены в однослойном пигментном эпителии. На стадии переходной от эмбрионального к плодному периоду пренатального развития человека (11—12 нед.) выявлен в сетчатке транскрипционный фактор PAX6. Другими авторами методом иммунохимии PAX6 был обнаружен на 8.5 нед. развития человека в нейробластах сетчатки, а на поздней стадии (21 нед.) — в ганглиозных клетках и в клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки [11]. Эти данные находятся в соответствии с полученными нами методом ПЦР результатами об экспрессии гена PAX6 в пренатальной сетчатке человека на 8.5-9.5 и 22 нед. гестации [12]. Мы локализовали белок PAX6 в дифференцирующихся ганглиозных клетках центральной области сетчатки и отдельных клетках внутренней части внутреннего ядерного слоя (амакриновых, горизонтальных) на 11-12 нед. развития. Обнаруженный градиент экспрессии транскрипционного фактора PAX6: от внутреннего к наружному ядерному слою сетчатки, а также от ее центра к периферии, отражает пространственную динамику дифференцировки клеток. Белок PAX6 локализовали не только в сетчатке, но и в ретинальном пигментном эпителии. В свете недавних сведений, полученных на модели развития глаза мыши, наши результаты согласуются с бифункциональностью транскрипционного фактора PAX6 в этих тканях глаза, имеющих общее эмбриональное происхождение из нейроэпителия глазного пузыря. Проявление функций гена PAX6 в тканях глаза зависит от влияния межтканевых взаимодействий и взаимодействий между компонентами регуляторных генных сетей [13]. На стадии переходной от эмбрионального к плодному периоду сохраняется сходство локализации экспрессии регуляторных факторов PAX6, FOXC1, PITX2 и TGFbeta2 в формирующихся ганглиозных клетках и клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки (предположительно амакриновых). С 13-й по 17-ю нед. гестации человека белки PITX2 и FOXC1 экспрессируются в обоих ядерных слоях сетчатки, а также в ганглиозных клетках, которые к этому времени образуют отдельный слой. Белок TGFbeta2 к 17-й нед. локализуется в ганглиозных клетках, слое нервных волокон, образованном отростками ганглиозных клеток в формирующемся внутреннем сетчатом слое, на границе внутреннего ядерного слоя, где находятся амакриновые клетки. Наши результаты свидетельствуют об участии TGFbeta2 в контроле дифференцировки ганглиозных и амакриновых клеток. Белки PITX2, FOXC1 и TGFbeta2 локализованы и в пигментном эпителии. На 22-й нед. развития человека локализация белков PITX2 и FOXC1 существенно меняется, в сетчатке оба белка выявлены только в ядрах ганглиозных клеток, а в пигментном эпителии не детектируются. Локализация TGFbeta2 на этой стадии также смещается в витреальную часть сетчатки и обнаруживается в нервных волокнах, сформированных аксонами ганглиозных клеток, дифференцировка которых близка к завершению. В пигментном эпителии на этой стадии мы выявили единичные клетки, экспрессирующие TGFbeta2. Известно, что функция TGFbeta2 в пигментном эпителии глаза взрослых млекопитающих связана с предотвращением прорастания кровеносных сосудов в сетчатку [14]. В развивающемся глазу человека TGFbeta2 может выполнять аналогичную функцию. На поздней стадии развития человека область экспрессии PITX2 и FOXC1 в сетчатке совпадает только в ядрах клеток ганглиозного слоя, а TGFbeta2 — в цитоплазме и аксонах ганглиозных клеток, формирующих зрительные пути. Источниками сигнального белка TGFbeta2 могут быть клетки пигментного эпителия, сосудистая оболочка, Мюллеровская глия [6, 15]. Предполагаем, что в развивающейся сетчатке человека TGFbeta2 поддерживает баланс между пролиферирующими, вступившими в апоптоз и дифференцирующимися клетками. Основные результаты нашего исследования, демонстрирующие солокализацию TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в ганглиозных клетках формирующейся сетчатки человека отражены на схеме (рис. 1).
Рисунок 1.
Пространственно-временная экспрессия регуляторных факторов TGFbeta2, PITX2, FOXC1, демонстрирующая их солокализацию в ганглиозных клетках формирующейся сетчатки глаза человека. Р — роговица; Х — хрусталик; ЦТ — цилиарное тело; С — сетчатка; ГК — ганглиозные клетки
Заключение
Таким образом, функция факторов PITX2 и FOXC1 связана не только с контролем формирования тканей переднего сегмента глаза, как считалось ранее, но также с участием в регуляции гистогенеза сетчатки и ретинального пигментного эпителия человека. Результаты по локализации транскрипционного фактора PAX6 в дифференцирующихся ганглиозных клетках и клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки (амакриновых, горизонтальных) на 11–12-й нед. развития человека согласуются с участием РАХ6/Pax6 в контроле дифференцировки этого типа нейронов в сетчатке позвоночных. Полученные нами результаты также дополняют сведения об экспрессии РАХ6 в сетчатке человека в ходе эмбриогенеза [11, 16]. Пространственно-временная динамика экспрессии регуляторных факторов PAX6, TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 коррелирует с дифференцировкой ганглиозных клеток сетчатки в ходе пренатального развития человека. Предполагаем, что в дифференцирующихся ганглиозных клетках исследуемые регуляторные факторы функционируют в общем сигнальном пути. Полученные результаты являются основой для изучения взаимодействий регуляторных генов в ходе формирования сетчатки в развитии и при патологиях глаза, в частности глаукоме, характеризующейся гибелью ганглиозных клеток сетчатки.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (№ 11-04-00728) и Программы Президиума РАН «Динамика и сохранение генофондов».
ЛИТЕРАТУРА
1. Adler R., Canto-Soler M.V. Molecular mechanisms of optic vesicle development: Complexities, ambiguities and controversies // Dev. Biol. — 2007. — Vol. 305. — P. 1-13.
2. Cvekl A. and Mitton K.P. Epigenetic regulatory mechanisms in vertebrate eye development and disease // Heredity. — 2010. — Vol. 105. — P. 135-151.
3. Reis L.M. and Semina E.V. Genetics of anterior segment dysgenesis disorders // Curr. Opin. Ophthalmol. — 2011. — Vol. 22, № 5. — P. 314-324.
4. Acharya M., Huang L.J., Fleisch V.C. et al. A complex regulatory network of transcription factors critical for ocular development and disease // Hum. Mol. Genet. — 2011. — Vol. 20, № 8. — P. 1-15.
5. Andreazzoli M. Molecular regulation of vertebrate retina cell fate // Birth Defects Research. 2009. — Vol. 87. — P. 284-295.
6. Close J.L., Gumuscu B. and Reh T.A. Retinal neurons regulate proliferation of postnatal progenitors and Muller glia in the rat retina via TGF beta signaling // Development. — 2005. — Vol. 132. — P. 3015-3026.
7. Duenker N. Transforming growth factor beta (TGF beta) and programmed cell death in the vertebrate retina // Int. Rev. Cytol. — 2005. — Vol. 245. — P. 17-43.
8. Ittner L.M, Wurdak H., Schwerdtfeger K. et al. Compound developmental eye disorders following inactivation of TGFβ signaling in neural-crest stem cells // J. Biol. — 2005. — Vol. 4, № 3. — P. 11.
9. Gould D.B., John S.W. Anterior segment dysgenesis and the developmental glaucomas are complex traits // Hum. Mol. Genet. — 2002. — Vol. 11. — P. 1185-1193.
10. Mann I. The development of human eye // University Press. Cambridge. British J. Ophthalmology. — 1928. — P. 306.
11. Nishina S., Kohsaka S., Yamaguchi Y. et al. PAX6 expression in the developing human eye // Br. J. Ophthalmol. — 1999. — Vol. 83, № 6. — P. 723-727.
12. Markitantova Yu.V., Smirnova Yu.A., Panova I.G. et al. Analysis of expression of regulatory genes Pax6, Prox1 and Pitx2 in differentiating eye cells in human fetus // Izv. Akad. Nauk. Ser Biol. — 2006. — Vol. 4. — P. 421-429.
13. Bharti K., Gasper M., Ou J. et al. A regulatory loop involving PAX6, MITF and WNT signaling controls retinal pigment epithelium development // PLoS Genet. — 2012. Vol. 8, № 7. — e. 1002757.
14. Bian Z.M., Elner S.G., Elner V.M. Regulation of VEGF mRNA expression and protein secretion by TGF-beta2 in human retinal pigment epithelial cells // Exp. Eye Res. — 2007. — Vol. 84, № 5. — P. 812-822.
15. Tan J., Deng Z.H., Liu S.Z. et al. TGFbeta2 in human retinal pigment epithelial cells: expression and secretion regulated by cholinergic signals in vitro // Curr. Eye Res. — 2010. — Vol. 35, №1. — P. 37-44.
16. Ferreiro-Galve S., Rodríguez-Moldes I., Candal E. Pax6 expression during retinogenesis in sharks: comparison with markers of cell proliferation and neuronal differentiation // J. Exp. Zool. B Mol Dev Evol. — 2012. — Vol. 318, № 2. — P. 91-108.
