Сферы клинического применения кросслинкинга роговичного коллагена


Представлены современные данные о нозологических вариантах офтальмологической патологии, при которой сегодня возможно применение кросслинкинга роговичного коллагена. Приведены данные изменения морфогистологической картины роговицы после проведения кросслинкинга. Освещены перспективы дальнейшего изучения данной процедуры в лечении других патологических состояний роговицы.

Sphere of Clinical application of corneal collagen cross-linking

In the article modern tendencies of corneal collagen cross-linking in different types of ophthalmic pathology are presented. Changes in morphohistological pattern after cross-linking are described. Perspectives in treatment other corneal pathologies using collagen cross-linking are examined.

В настоящее время наряду с хирургическими технологиями активно внедряются новые методики лечения патологии роговицы, одним из таких методов является метод роговичного коллагенового кросслинкинга (также известного как метод UV-x-linking, С3-R, crosslinking method, UVA method, CCL method), который представляет собой фотополимеразацию стромальных волокон, и образование стабилизирующих химических связей, возникающих в результате комбинированного воздействия фотосенсибилизирующего вещества (рибофлавин, или витамин В2) и ультрафиолетового света. Фотополимеризация увеличивает упругость и прочность коллагена, и, таким образом, повышает сопротивляемость кератэктазии. В результате фотополимеризации образуются новые дополнительные внутри- и межфибриллярные связи (поперечные сшивки), что изменяет прочность и устойчивость материала роговицы в целом.

Метод был предложен в 1999 году профессором Теодором Зейлером и его соавторами для лечения ряда глазных заболеваний. Основной целью применения метода является приостановка прогрессии кератоконуса. Однако в последнее время показания для применения кросслинкинга заметно расширились. Так, метод успешно используется для приостановки прогрессирования вторичного кератоконуса (ятрогенной кератэктазии после ЛАСИКа), пеллюцидной маргинальной дистрофии, кератомаляции различного генеза, а также в лечении буллезной кератопатии с болевым синдромом. Известно, что ультрафиолет и рибофлавин обладают антибактериальным и противоотечным действием. В связи с этим метод роговичного кросслинкинга рекомендуется в лечении язв роговицы и бактериальных кератитов.

Идея и разработка метода кросслинкинга роговичного коллагена принадлежит группе исследователей Дрезденского Технического Университета, перед которыми встала задача достичь стабилизации кератэктазии при кератоконусе с целью максимальной отсрочки кератопластики. Основанием для проведения исследований в этой области послужила серия работ, посвященных эффекту «склеивания» фибрилл коллагена с образованием димеров из двух α-цепей под влиянием различных внешних факторов: ферментов, озона, ультрафиолетового излучения и т.д.


Данный эффект является результатом окислительного механизма, сопровождающегося высвобождением различных свободных радикалов. Оказалось, что в отличие от других способов индукции «склеивания», ультрафиолетовое излучение стимулирует образование синглетного кислорода, не вызывающего, в отличие от гидроксильного радикала, сопутствующей деградации CNBr белков коллагена [1].

Кроме того, была подтверждена способность ультрафиолетового излучения стимулировать продукцию матриксных металлопротеиназ [2]. В эксперименте было выявлено, что в присутствии рибофлавина степень абсорбции ультрафиолетового излучения в ткани роговицы повышалась с 32 до 95%, а повреждение коллагеновых белков под воздействием ультрафиолетового облучения сводилось к минимуму [2]. Первые исследования в офтальмологии были начаты в 1990 году попыткой оценить возможность биологического окислительного «склеивания» роговичного коллагена под воздействием энзимов, тепла или излучения определенной длины волны, что приводило бы к повышению резистентности стромального коллагена [3].

Wollensak с группой исследователей с помощью электронной микроскопии подтвердили факт «склеивания» фибрилл и утолщения коллагеновых волокон в роговице под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового излучения, что приводило к повышению биомеханической устойчивости ткани. В передних отделах стромы диаметр коллагеновых волокон достоверно повышался на 12,2% (3,64 нм), в задних отделах стромы диаметр волокон увеличивался лишь на 4,6% (1,63 нм). Выявленные изменения оказываются значительно ниже критического порога толщины волокон, приводящего к помутнению роговицы [4].

Стабилизирующий биохимический эффект кросслинкинга может быть объяснен изменением третичной структуры коллагеновых фибрилл и блокированием специфических участков, взаимодействующих с ферментами. Данный факт объясняет эффективность метода в лечении язвы роговицы, а также частично обуславливает остановку прогрессирования кератоконуса, в патогенезе которого также играет роль повышенная активность коллагеназы. Подобный эффект повышения устойчивости ткани к коллагеназной биодеградации в результате процедуры кросслинкинга широко используется в современных биотехнологиях изготовления различных имплантов на основе коллагена [5].


Помимо биомеханического и биохимического эффекта, процедура кросслинкинга роговичного коллагена ведет к формированию повышенной устойчивости роговицы к термическому воздействию. Денатурация коллагена с разрушением ковалентных связей между молекулами в роговицах, подвергшихся комбинированному воздействию UVA и рибофлавина, происходила при более высокой температуре, чем в контроле [6].

Гистология и цитология

Еще в 1981 году С.Н. Багровым было высказано предположение о целесообразности разработки таких мероприятий, которые при различных повреждениях стромы активизировали бы кератогенез в роговице.

Кератоциты собственного вещества роговицы представляют собой высокодифференцированные фибробласты (Шепкалова В.М., 1962; Hogan, Zimermann, 1968). Эти клетки имеют вытянутую форму и содержат многочисленные отростки, дающие им возможность соединяться друг с другом в пределах различных пластов. Веретенообразные ядра кератоцитов, как правило, окружены небольшой зоной цитоплазмы. На электронограммах в цитоплазме этих клеток обнаруживают рибосомы, пластинчатый комплекс, цитоплазматический ретикулеум и небольшое число митохондрий (Jukus, 1965; Pouliguen, 1963, 1965; Smelser, Ozanis, 1965).

Обновление стромальных клеток роговицы происходит в основном за счет их митотического деления. В норме митотический индекс кератоцитов очень низок и существенно увеличивается при травмах. Способность к митозу в этих случаях приобретают кератоциты вокруг очага повреждения на расстоянии не более1 мм(Багров С.Н., 1979). Именно поэтому при обширных поражениях стромы (например, ожогах, ранениях) образующихся в результате деления кератоцитов не хватает для восстановления дефектов, и в процесс вовлекаются клетки из окружающих тканей.

Известно, что биомеханические свойства роговицы зависят от состояния волокон коллагена [7, 8], межколлагеновых связей [9] и их структурной организации [10].

В человеческой роговице в норме коллагеновые волокна ориентированы преимущественно горизонтально и вертикально (под углом 90° и 180°), параллельно друг другу и поверхности роговицы, что определяет ее кривизну и прозрачность. Подобная закономерность имеет место на большей части роговицы, за исключением полосы шириной2 ммвдоль лимба. [11, 12].

Кросслинкинг роговичного коллагена, укрепляет структуру и прочность роговицы при кератоконусе, эффекты достигаются за счет создания связей — мостиков между углеродными основаниями, а также фотополимеризации, которая усиливает прочностные свойства роговичного коллагена, и, следовательно, увеличивает ее сопротивляемость (ригидность) кератэктазии.

Расширение спектра показаний к данной процедуре стало возможно благодаря ее малой инвазивности, простоте выполнения и экономичности, что способствует активному научному и практическому изучению и широкому распространению. В настоящее время во всем мире активно ведутся исследования по изучению биохимического, биомеханического и других биотехнологических возможностей кросслинкинга.

Ультрафиолетовая сенсибилизация с рибофлавином обладает бактерицидным и бактериостатическим действием в отношении широкого спектра патогенных микроорганизмов. Имеются убедительные доказательства того, что кросслинкинг роговичного коллагена может быть эффективным при лечении инфекционной патологии роговицы, а в частности кератита бактериальной этиологии. Это утверждение доказано работами Martins и др., которые продемонстрировали в эксперименте, что комбинация UV-A и рибофлавина может эффективно уменьшить бактериальный рост в чашках с агаровой средой. Было также установлено, что эта комбинация более эффективна при ингибировании бактериального роста, чем использование UV-A отдельно. Рибофлавин и продукты его распада изучались в течение долгого времени и доказали высокую безопасность применения [13-15].

Имеются данные о наличии паллиативного терапевтического эффекта при использования кросслинкинга с рибофлавином у пациентов с буллезной кератопатией. Положительное воздействие рибофлавина и УФ при эндотелиальной дистрофии было описано Ehlers и Hjortdal. Наблюдалось уменьшение толщины роговицы и исчезновение роговичных булл. Кроме того, воздействие кросслинкинга при отеке роговицы вследствие эндотелиальной дисфункции обратно пропорционально объему дисфункции, т.е. максимальный терапевтический результат можно ожидать на ранних стадиях эндотелиальной дистрофии [16-18].

Вторичная кератэктазия является возможным осложнением радиальной кератотомии и мини-асимметричной радиальной кератотомии, проведенной у пациентов с латентным кератоконусом и/или миопией. В данном случае радиальная кератотомия вызвала такое осложнение как ослабление стабильности роговицы, т.е. увеличение кривизны периферии и центральное уплощение. Эти эффекты обусловлены глубокими стромальными разрезами в области лимба, которые изменяют биомеханическую стабильность роговицы [19-21].

Этиология рефракционных изменений все еще неизвестна, хотя существуют различные гипотезы. В послеоперационном периоде (от 1 до 10 лет) может произойти изменение рефракционной силы роговицы в сторону гиперметропии чаще всего после радиальной кератотомии, даже в близоруких глазах без кератоконуса. Это осложнение затрагивает остроту зрения, вызывая ее флюктуации, не корригируемые очками из-за рефракционной нестабильности и прогрессирующей роговичной асимметрии [19-21].

Кросслинкинг роговичного коллагена активно комбинируют с такими методами хирургического вмешательства, как LASIK и имплантация интрастромальных сегментов. При этом необходимо избежать осложнений, таких как передний стромальный некроз, вызванный дополнительным повреждением рефракционной операции, выдерживая интервал между этими хирургическими вмешательствами примерно в 3-4 месяца и до завершения полного процесса эпителизации [22].

Нами проведена серия лабораторных экспериментов по применению кросслинкинга в качестве метода лечения проникающих и непроникающих ранений роговицы. Известно, что помутнение роговицы после повреждения стромы роговицы связано с дезорганизацией фиброзной ткани [23]. В результате первой серии эксперимента нами были получены морфологические данные, свидетельствующие о положительном влиянии кросслинкинга на течение раневого процесса в строме роговицы. Морфогистологические изменения, происходящие в строме травмированной роговицы после проведения кросслинкинга характеризовались: активацией кератогенеза в зоне повреждения стромы, преобразованием молодыми кератоцитми фиброцеллюлярной ткани в полноценную строму с оптическими свойствами (при сроке наблюдения 6 месяцев). Во второй серии эксперимента была использована модель передней послойной кератопластики, процедура кросслинкинга была проведена в раннем послеоперационном периоде. Морфологическое исследование гистологических препаратов выявило полное соответствие ложа роговицы и роговичного трансплантата в виде абсолютной конгруэнтности их поверхностей (геометрически они идеально соответствовали друг другу, границу между ними даже на гистологическом уровне было невозможно отдифференцировать), признаки уплотнения и упрочнения коллагеновых волокон в верхней 1/3 стромы за счет появления молодых кератоцитов (срок наблюдения 4-6 месяцев).

Таким образом, дальнейшее изучение влияния кросслинкинга является перспективным и необходимым научным направлением в офтальмологии, в том числе с использованием новых экспериментальных моделей.

 

В.В. Нероев, А.Б. Петухова, Р.А. Гундорова, О.Г. Оганесян 

НИИ глазных болезней имени Гельмгольца МЗ РФ, г. Москва 

Петухова Анастасия Борисовна — аспирант отдела травм органа зрения, реконструктивно-пластической хирургии и глазного протезирования

 

 

Литература:

1. Fujimori E. Cross-linking and Fluorescence Changes of Collagen by Glycation and Oxidation // Biochimica et Biophisica Acta. — 1989. — № 998(2). — Р. 105-110.

2. Menter J.M., Patta A.M., Sayre R.M. et al. Effect of UV Irradiation on Tipe I Collagen Fibril Formation in Neural Collagen Solutions // Photodermatol. Photoimmunol. — Photomed. — 2001. — Vol. 17. — Р. 114-120.

3. Khaderm J., Truong T., Ernest J.T. Photodynamic Biologic Tissue Glue // Cornea. — 1994. — № 13. — Р. 406-410.

4. Wollensak G., Wilsch M., Spoerl E. et al. Collagen Fiber Diameter in the Rabbit Cornea after Collagen Crosslinking by Riboflavin/UVA // Cornea. — 2004. — Vol. 23, N. 5. — Р. 503-507.

5. Spoerl E., Wollensak G., Seiler T. Increased Resistance of Crosslinked Cornea against Enzymatic Digestion // Current Eye Research. — 2004. — Vol. 29, N. 1. — Р. 35-40.

6. Spoerl E., Wollensak G., Dittert D. et al. Thermomechanical Behavior of Collagen-Cross-Linked Porcine Cornea // Ophthalmologica. — 2004. — Vol. 218. — Р. 136-140.

7. Cheng E.L., Maruyama I., Sundar Raj N. et al. Expression of Type XII Collagen and Hemidesmosomeassociated Proteins in Keratoconus Corneas // Curr. Eye Res. — 2001. — № 22. — Р. 333-340.

8. Tuori A.J., Virtanen I., Aine E. et al. The Immunohistochemical Composition of Corneal Basement membrane in Keratoconus // Curr. Eye Res. — 1997. — 16. — Р. 792-801.

9. Kenney M.C., Nesburn A.B., Burgeson R.E. et al. Abnormalities of the Extracellular Matrix in Keratoconus Corneas // Cornea. — 1997. — №16(3). — Р. 345-351.

10. Radner W., Zehemayer M., Skorpik Ch. et al. Altered Organization of Collagen in Apex of Keratoconus Corneas // Ophthalmic Res. — 1998. — № 30. — Р. 327-332.

11. Meek K.M., Tuft S.J., Huang Y. et al. Changes in Collagen Orientation and Distribution in Keratoconus Corneas // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. — 2005. — Vol. 46, N. 6. — Р. 1948-1956.

12. Muller L.J., Pels E., Vrensen G.F. The Specific Architecture of the Anterior Stroma Accounts for Maintenance of Corneal Curvature // Br. J. Ophthalmol. — 2001. — Vol. 85. — Р. 437-443.

13. Makdoumi K., Mortensen J., Crafoord S. Infectious Keratitis Treated With Corneal Crosslinking // Cornea. — 2010. — Vol. 29, N. 12. — P. 1353-1358.

14. Ruane P.H., Edrich R., Gampp D. et al. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light // Transfusion. — 2004. — № 44. — Р. 877-885.

15. Gokhale N.S. Corneal Endothelial Damage After Collagen Cross-Linking Treatment // Cornea. — 2011. — № 30 (12). — Р. 1495-1498.

16. Kozobolis Vassilios, Labiris Georgios, Gkika Maria et al. Collagen Cross-Linking Treatment of Bullous Keratopathy Combined With Corneal Ulcer // Cornea. — 2010. — Vol. 29, N. 2. — P. 235-238.

17. Wilson S.E. Keratocyte apoptosis in refractive surgery // CLAO J. — 1998. — № 24. — Р. 181-185.

18. Mitooka K., Ramirez M., Maguire L.J. et al. Keratocyte density of central human cornea after laser in situ keratomileusis // Am J Ophthalmol. — 2002. — № 133. — Р.307-314.

19. Mazzotta C, Baiocchi S., Denaro R. et al. Corneal Collagen Cross-Linking to Stop Corneal Ectasia Exacerbated by Radial Keratotomy // Cornea. — 2011. — Vol . 30, N. 2. — Р. 225-228.

20. Moller-Pedersen T. Keratocyte reflectivity and corneal haze // Exp Eye Res. — 2004.-

78. — Р.553-560.

21. Ivarsen A., Laurberg T., Moller-Pedersen T. Characterisation of corneal fibrotic wound repair at the LASIK flap margin // Br J Ophthalmol. — 2003. — № 87. — Р. 1272-1278.

22. Wollensak Gregor, Iomdina Elena, Dittert Dag-Daniel Wound Healing in the Rabbit Cornea After Corneal Collagen Cross-Linking With Riboflavin and UVA // Cornea. — 2007. — Vol. 26, N. 5. — P. 600-605.

23. Cintron C., Kublin C.L. Regeneration of corneal tissue Wound Healing in the Rabbit Cornea After Corneal Collagen Cross-Linking With Riboflavin and UVA // Dev Biol. — 1977. — № 61. — Р. 346-357.