Влияние биологически активного вещества С14 на проницаемость клеточной мембраны зависит от ее исходного генетически детерминированного состояния


О.В. ОРЛОВА, В.Н. ОСЛОПОВ, С.А. СИДУЛЛИНА 

Казанский государственный медицинский университет 

Орлова Ольга Валериановна

аспирант кафедры фармации ФПК и ППС 

 В статье представлены результаты изучения изменений скорости Na+-Li+-противотранспорта (Na+-Li+-ПТ) в мембране эритроцита под влиянием биологически активного вещества [(С6Н5)3P+C14H29] Brпо методу M. Canessa et al. Исследование показало, что у лиц, имеющих мембранные нарушения («мембранный дефект» по Ю.В. Постнову), т.е. высокую скорость Na+-Li+-ПТ (IV квартиль), вещество С14 уменьшает эту исходно высокую проницаемость клеточных мембран — снижает скорость Na+-Li+-ПТ. У лиц, имеющих исходно самую низкую мембранную проницаемость, т.е. относящихся к I квартилю скорости Na+-Li+-ПТ, вещество С14 никакого влияния на проницаемость клеточных мембран не оказывает. У лиц, имеющих средние значения скорости Na+-Li+-ПТ, т.е. относящихся к III квартилю скорости Na+-Li+-ПТ, вещество С14 увеличивает эту проницаемость. Таким образом, различие в генетически детерминированной исходной проницаемости клеточной мембраны определяет различное влияние биологически активного вещества С14 на мембранную проницаемость in vitro.


Ключевые слова: биологически активное вещество, проницаемость мембран эритроцитов, Na+-Li+-противотранспорт. 

O.V. ORLOVA, V.N. OSLOPOV, S.A. SIDYLLINA

Kazan State Medical University 

Influence of biologically active substance С14 on permeability of a cell membrane depends on its initial genetically determined condition


The article presents the study results of speed change of Na+-Li+-counter transport (Na+-Li+ПТ) in erythrocyte membrane under the influence of biologically active substance [(С6Н5)3P+C14H29] Braccording to method M. Canessa et al. The study showed that patients with membranous disorders («membrane defect» by YU.V. Postnov), i.e. high rate of Na +-Li +-PT (IV quartile), had initially high permeability of the cell membranes reduced by element С14 — speed of Na+-Li+ПТ is reduced. Patients having initially very low membrane permeability, i.e. relating to the 1st quartile of speed Na+-Li+PT, С14 has no effect on the permeability of cell membranes. Patients having an average value of speed Na+-Li+-PT, i.e. relating to the 1st quartile of speed Na+-Li+PT, С14 increases the permeability. Thus, the difference in genetically determined initial permeability of the cell membrane determines the different effects of biologically active substance on the С14 membrane permeability in vitro.

Key words: biologically active substance, membranes’ permeability of erythrocytes, Na+ Li+сounter transport. 

 

Биодоступность биологически активных веществ (БАВ) характеризуется их высвобождением из лекарственных форм. Кинетику высвобождения вещества из лекарственной формы изучают методом равновесного диализа через полупроницаемую мембрану. Известно, что в качестве искусственных мембран используют тефлоновые мембраны [1], мембраны из силиконов, полиуретана, 2-полигидроксиэтиленметакрилата [2], производных целлюлозы. Однако результаты, полученные с использованием искусственных мембран, по ряду причин дают лишь относительное представление о проникновении лекарственных веществ из лекарственных форм через кожу. В биофармацевтических исследованиях для приближения экспериментальных моделей к условиям in vivo широко используются в качестве диализных мембран биологические объекты: обезволошенная кожа мыши [3], тонкие лоскуты кожи человека, взятой в процессе хирургического вмешательства, кожа человека после пластической операции, кожа трупа человека [4], сброшенная кожа змеи [5].

В последние годы для изучения проницаемости стали использовать мембраны клеток крови [6]. В качестве естественной модели для исследования общих характеристик, в том числе проницаемости всех биологических мембран, наиболее удобны эритроциты, так как была доказана корреляция между изменениями свойств мембран эритроцитов и клеточных мембран внутренних органов. Метаболические процессы, протекающие в клетках крови, в частности в эритроцитах, при стрессе и клинической патологии отражают реакцию клеток на уровне всего организма [7]. Мембрана эритроцита представляет собой пластичную молекулярную мозаику, состоящую из белков, липопротеинов и гликопротеинов и, возможно, чисто липидных участков. Перенос веществ через мембрану совершается в зависимости от их химических свойств разными способами: гидродинамически (путем диффузии) или путем проникновения через липидные участки. Некоторые вещества способны вступать в легко обратимые связи со встроенными в мембрану молекулами-переносчиками, и в дальнейшем они или пассивно, или в результате так называемой облегченной диффузии проходят через мембрану.

Оценить проницаемость клеточной мембраны по Na+ можно, изучая облегченную диффузию Na+, осуществляемую белком-переносчиком, по методике M. Canessa и соавт. [8].

В.Н. Ослоповым были определены границы так называемых квартилей (КВ) популяционного распределения величин скорости Na+-Li+-противотранспорта (Na+-Li+-ПТ) в мембране эритроцита: I КВ — 38-203, II КВ 204-271, III КВ — 272-345, IV КВ — 346-730 микромолей Li на 1 литр клеток (эритроцитов) в час (мкМ Li). Условно можно считать, что величины скорости Na+-Li+-ПТ I КВ соответствуют низкой проницаемости по Na+, II КВ — средней, III КВ — умеренно высокой, IV КВ — высокой проницаемости по Na+ [9, 10].

В наших предшествующих работах было показано, что вещество С14 [11], обладающее антибактериальным и фунгицидным действиями, по-разному влияет на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита у исследуемых, принадлежащих к I и III квартилям скорости Na+-Li+-ПТ [12]. В настоящей работе мы провели исследование проницаемости клеточной мембраны по Na+ под влиянием вещества С14 у пациентов IV квартиля скорости Na+-Li+-ПТ, т.е. у лиц, имеющих наибольшую исходную высокую проницаемость по Na+ (имеющих так называемые мембранные нарушения («мембранный дефект») по Ю.В. Постнову) [13].

Цель данного исследования — определить влияние трифенилтетрадецилфосфония бромида [(С6Н5)3P+C14H29] Br14) на проницаемость мембран клеток по Na+ in vitro путем измерения скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита с позиции его различного исходного состояния.

Материал и методы

Исследования проводили на 15 здоровых добровольцах, соответствующих I КВ, III КВ и IV КВ скорости Na+-Li+-ПТ (по 5 человек в каждом квартиле). Ранее нами были подобраны параметры определения скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита применительно к задачам исследования и концентрации этого вещества для исследования in vitro* [6,14]— заявка 2012101527 «Способ оценки влияния лекарственных веществ на проницаемость клеточных мембран по натрию» (РФ); заявл.16.01.2012; опубл. 10.06.2012, Бюл. № 16.

Изучали влияние различных концентраций С14 на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита in vitro. Определение скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита (в микромолях лития на 1 л клеток в час) проводили по методу M. Canessa и соавт. [8], при котором изучают обмен внутриклеточного лития в загруженных этим ионом клетках на внеклеточный натрий и магний из среды инкубации.

Концентрацию лития регистрировали методом атомной абсорбционной спектрофотометрии в эмиссионном режиме (СА-455, г. Казань). Кровь в количестве 3 мл забирали из вены самотеком в пластиковые пробирки, смоченные гепарином (20 ЕД на 1 мл крови), содержимое перемешивали, пробирки помещали в контейнер с тающим льдом. Исследование состояло из следующих этапов: отделение эритроцитов, промывание эритроцитов, прединкубация — нагрузка литием эритроцитов (3 ч), промывание эритроцитов, инкубация — выход лития из эритроцитов (1 ч), определение концентрации лития, вычисление конечного результата. Исследуемое вещество в различных концентрациях вносили в среду В (среда с Na при 1 часовой инкубации). Исследования проводили со следующими концентрациями вещества С14: 0,001; 0,005; 0,01; 0,025; 0,05 мкМ. Оценку влияния изучаемого вещества на проницаемость клеточных мембран по Na+ проводили путем подбора концентрации, которая не вызывала гемолиза эритроцитов; гемолиз определяли визуально. Средняя величина скорости Na+-Li+-ПТ у людей I КВ Na+-Li+-ПТ составила 188±8мкМ Li, у людей III КВ — 337±5 мкМ Li, у людей IV КВ — 568±5 мкМ Li (межквартильно р<0,05).

Результаты исследований

Исследования показали, что изменение скорости Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита под влиянием вещества С14 зависело от исходной проницаемости мембраны по Na+. У исследуемых, принадлежащих к I КВ скорости Na+-Li+-ПТ (низкая проницаемость мембран по Na+), под влиянием всех изучаемых концентраций БАВ С14 изменения скорости Na+-Li+-ПТ не произошло (р>0,05).

У исследуемых, принадлежащих к III КВ (исходно умеренно высокая проницаемость по Na+), при введении вещества [(С6Н5)3P+C14H29] Br (С14) в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ проницаемость по Na+ увеличилась на 12,7 и 11,3% (р<0,05).

У исследуемых, принадлежащих к IV КВ скорости Na+-Li+-ПТ (исходно высокая проницаемость мембран по Na+), при введении исследуемого БАВ С14 в концентрациях 0,001 и 0,005 мкМ проницаемость по Na+ не изменилась, в то же время при концентрации 0,05 мкМ она понизилась на 8,2% соответственно (р<0,05 по сравнению с исходной величиной скорости Na+-Li+-ПТ (табл. 1, рис. 1).

Таблица 1.

Влияние фармакологически активного вещества [(С6Н5)3P+C14H29] Br14на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита (в мкМ Li, М±m) у индивидуумов I, III, IV квартилей скорости Na+-Li+-ПТ 

№ квартиля

Исходная величина скорости

Na+Li+-ПТ

Концентрация вещества С14 в µМ

 

0,001

0,005

0,010

0,025

0,05

I

188±8

204±12

205±6

177±9

194±4

193±2

III

337±5

430±27*

381±5*

359±7

355±8

343±7

IV

568±5

588±6

550±9

588±4

575±10

465±6*

* достоверные различия с исходным значением скорости Na+-Li+-ПТ (р<0,05)

 

Рисунок 1. Влияние фармакологически активного вещества С14 на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита у индивидуумов I, III, IV квартилей скорости Na+-Li+-ПТ

1

* достоверные различия с исходным значением скорости Na+-Li+-ПТ (р<0,05)

 

Выводы

1. Изменение проницаемости клеточной мембраны по натрию под влиянием вещества [(С6Н5)3P+C14H29]Br14) зависит от исходного генетически детерминированного состояния клеточной мембраны.

2. Исследуемое вещество С14 по-разному влияет на скорость Na+-Li+-ПТ в мембране эритроцита у исследуемых, принадлежащих к I, III и IV квартилям скорости Na+-Li+-ПТ. У людей с исходно низкой проницаемостью по Na+ вещество С14 не изменяет скорость Na+-Li+-ПТ, у лиц с исходно умеренно высокой проницаемостью по Na+ вещество С14 в дозах 0,001 и 0,005 мкМ увеличивает скорость Na+-Li+-ПТ, у лиц же с исходно высокой проницаемостью по Na+ вещество С14 в дозе 0,05 мкМ уменьшает скорость Na+-Li+-ПТ.

 

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Juhasz J., Mahashabde S., Sequeira J. Comparison of in vitro release rates of nitroglycerin by diffusion througha Teflon membrane to the USP method // Drug Dev. And Ind. Pharm. — 1996. — Vol. 22. — P. 1139-1144.

2. Pulat M., Abbasoglu U. Water and antimicrobial agent permetation of PU and PHEMA membranes in relation to their surface and bulk properties // J. Biomater. Appl. — 1995. — Vol. 9. — P. 363-371.

3. Lien E. J., Gan H. QSAR analysis of skin permeability of various drugs in man as compared to in vivo and in vitro studies in rodents // Pharm. Res. — Vol. 12. — P. 583-587.

4. Sarpotdar P.P., Gaskill J.L., Giannini R.P. Effect of polyethylene glycol 400 on the penetration of drugs through human skin in vitro // J. Pharm. Sci. — 1986. — Vol. 75. — P. 26-28.

5. Sieh Hearam, Jun H.W. Effectiveness and mode of action of isopropyl myristate as a permeation enhancer for naproxen throught shed snake skin // J. Pharm. Sci. — 1996. — Vol. 48. — P. 812-816.

6. Орлова О.В., Егорова С.Н., Ослопов В.Н. Исследование влияния диметилсульфоксида на проницаемость клеточных мембран // Казан. мед. ж. — 2011. — Т. XCII, № 6. — С. 901-904.

7. Михайлович В.А., Марусанов В.В., Бичун А.Б., Доманская И.А. Проницаемость эритроцитарных мембран и сорбционная способность эритроцитов — оптимальные критерии тяжести эндогенной интоксикации // Анестезиология и реаниматология. — 1993. — № 5. — С. 66-69.

8. Canessa M., Adragna N., Solomon H. et al. Increased sodium-lithium countertransport in red cells of patients with essential hypertension // New Engl. J. Med. — 1980. — Vol. 302. — P. 772-776.

9. Ослопов В.Н., Заббарова А.Т., Богданов Э.И. Клиническое значение определения ионтранспортных функций клеточных мембран при гипертонической болезни и ее церебральных осложнениях // Казан. мед.ж. — 2000. — Т. XXXI, № 3. — С. 211-215.

10. Ослопов В.Н., Пикуза О.И., Вахитов Х.М., Кораблева А.А. Скорость натриево-литиевого противотранспорта в мембране эритроцита у часто болеющих детей // Педиатрия. — 2006. — № 3. — С. 21-24.

11. Галкина И.В., Мельникова Н.Б., Тудрий Е.В. и др. Взаимодействие солей фосфония с липидными компонентами мембран // Фармация. — 2009. — № 4.— С. 35-38.

12. Орлова О.В., Ослопов В.Н., Сидуллина С.А. Влияние трифенилтетрадецилфосфония бромида на скорость Na+-Li+-противотранспорта в мембране эритроцита у пациентов с генетически различной проницаемостью мембран по натрию // Казан. мед. ж. — 2012. — Т. XCIV, № 5. — С. 789-791.

13. Постнов Ю.В., Орлов С.Н. Первичная гипертензия как патология клеточных мембран. — М.: Медицина, 1987. — 192 с.

14. Орлова О.В., Ослопов В.Н., Сидуллина С.А. Влияние новых синтезированных веществ С10, С12, С14, С16, С18 на проницаемость клеточных мембран для ионов натрия в модели in vitro // Казан. мед. ж. — 2012. — Т. XCIII, № 3. — С. 505-507.