Проведено сравнительное исследование ранозаживляющего действия биорегуляторов, выделенных из роговицы и сыворотки крови глаза крупного рогатого скота на модели травмы роговицы кроликов in vivo. Наиболее эффективное ранозаживляющее действие оказывали биорегуляторы, выделенные из роговицы и сыворотки крови, которые инстиллировали в глаза кроликам последовательно с интервалом 15-20 мин 2 раза в сутки: в области раны наблюдали многоклеточный эпителий, небольшое воспаление в строме.
The influence of complex nanosized bioregulators, isolated from tissue bull on the restorative processes in experimental corneal injury
A comparative study of early wound healing, achieved by bioregulators, derived from cornea and the blood serum of bovine, on the model of injured corneas of rabbits in vivo was conducted. The most effective wound healing process received by bioregulators, derived from cornea and blood serum, which are instilled into the eyes of rabbits, in series with an interval 15-20 minutes twice daily: in the wound area was been observed multicellular epithelium, slight inflammation in the stoma.
Поиск и исследование биорегуляторов, осуществляющих контроль за такими важнейшими процессами, как клеточная адгезия, пролиферация, дифференцировка и морфогенез, продолжают оставаться актуальными задачами современной медико-биологической науки. Разработка новых эффективных лекарственных средств, характеризующихся высокой степенью безопасности, продолжает оставаться актуальной проблемой современной офтальмологии. В этом аспекте большое внимание привлекают различные природные соединения, которые, с одной стороны, могут влиять на ход и направленность основных биологических процессов, а с другой — характеризуются отсутствием неблагоприятного воздействия на ткани [1-3].
При исследовании путей передачи информационного сигнала в живых системах нами была идентифицирована группа новых ранее не изученных биорегуляторов белковой природы, локализованных в межклеточном пространстве тканей животных и растений.
Это оказалось возможным благодаря разработке определенного экспериментального подхода, включающего способ выделения данных биорегуляторов из тканей, методы их очистки и биотестирования, а также экспериментальные модели исследования их специфической активности in vitro [2, 3].
От других молекул, участвующих в процессах регуляции, биорегуляторы данной группы отличаются способностью в сверхмалых дозах (10-8-10-12 мг/мл) стимулировать восстановление и репарацию в патологически измененных тканях, т.е. способствовать восстановлению структуры этих тканей и их функции. Биологическая активность биорегуляторов данной группы характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности. Было установлено, что в основе механизма действия данных биорегуляторов лежит их способность влиять на основные биологические процессы — клеточную адгезию, миграцию, дифференцировку, пролиферацию, работу основных тканевых ферментных систем. Но самым значительным в этом аспекте является экспериментально доказанный факт дополнительной активации клеточных источников регенерации в тканях (стволового отдела), развивающейся при воздействии биорегуляторов. Полученные нами данные показывают, что по своей сути биорегуляторы этой группы являются регуляторами органо-тканевого гомеостаза [4-6].
Анализ огромного количества экспериментальных данных позволяет отметить, что биорегулятор, выделенный из роговицы глаза быка, оказывал выраженное протективное действие на состояние ткани при культивировании роговицы глаза in vitro, за счет способности дополнительно активировать клеточные источники регенерации. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, стимулировал ранозаживление роговицы у кролика в эксперименте in vivo, а также у человека при посттравматической рецидивирующей эрозии и ожоге роговицы [6-8].
Цель работы — сравнительное исследование влияния биорегуляторов, выделенных из роговицы и сыворотки крови крупного рогатого скота, на ранозаживление экспериментальной травмы роговицы у кроликов in vivo.
Материалы и методы
Исследование проведено на 15 самцах кроликов породы шиншилла массой около 1,5 кг, которых содержали в стандартных условиях в виварии ИБР РАН. Для выделения сывороточного биорегулятора использовали препарат «Сыворотка крови крупного рогатого скота, стерильная, инактивированная», применяемый в качестве питательной добавки в ростовую среду культур клеток и тканей (производство Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН).Для выделения биорегуляторов тканей глаза использовали свежеэнуклеированные глаза молодых бычков мясоперерабатывающих предприятий г. Москвы и Московской области. Все биорегуляторы получали по ранее разработанной схеме выделения и очистки, состоящей из получения тканевого экстракта, высаливания примесных белков в насыщенном растворе сернокислого аммония, получения фракции супернатанта и последующего разделения ее методом изоэлектрофокусирования в градиенте сахарозы в интервале рН 3,5-10,0. Изучали фракции кислых белков сыворотки крови и роговицы, которые собирали в интервале рН 15-3,0. Биорегуляторы исследовали в концентрации, соответствующей 10-12 мг белка/мл, которую получали путем последовательного 10-кратного разбавления исходного раствора. Концентрацию белка в исходных фракциях биорегуляторов определяли колориметрическим методом.
В качестве дополнительного контроля использовали физиологический раствор, а также офтальмологический препарат «Баралпан-Н» (глазные капли, производство ООО «НЭП Микрохирургия глаза»), который применяется для лечения повреждений роговицы после травм и операционного вмешательства.
Для проведения эксперимента кролики были разделены на группы по 3 особи в каждой. На кроликах 1-й группы изучали действие биорегулятора, выделенного из сыворотки крови; 2-й — из роговицы глаза быка; 3-й — изучали действие композиции биорегуляторов, выделенных из роговицы и сыворотки крови, в виде общего раствора; в 4-й — действие биорегуляторов, выделенных из роговицы глаза и сыворотки крови быка, при их последовательной инстилляции (интервал времени 15-20 мин); в 5-й группе изучали действие офтальмологического препарата «Баралпан-Н».
У каждого животного один глаз являлся опытным, в него закапывали изучаемый препарат; другой — контрольным, в который инстиллировали физиологический раствор.
Все препараты и физиологический раствор инстиллировали в течение 21 суток по 2 капли в каждый глаз 2 раза в сутки (интервал 8 ч). Клинические исследования глаз кроликов проводили на 10-е сутки после нанесения экспериментальной травмы. Время проведения каждого исследования составляло 60 с.
Эпителизацию роговицы оценивали с помощью флюоресцеинового теста, применяя стерильные одноразовые бумажные полоски с флюоресцеином (Haag-Streit AG).
Слезопродукцию в послеоперационном периоде оценивали по пробе Ширмера, используя одноразовые тест-полоски (Buch and Lomb). Тест Ширмера (количество слезы, выделившейся за 60 с. из глаза) измеряется с помощью специальной полоски, вставляемой под веко кролику (длина намокшей полоски, мм). В норме тест Ширмера для кролика составляет 7 мм.
Измерение внутриглазного давления проводили с помощью автоматического тонометра Tonovet (Tiolat).
На 21-е сутки после травмы кроликов выводили из эксперимента методом воздушной эмболии, роговицы выделяли для гистологических исследований, для чего их фиксировали в фиксаторах Буэна и 4%-ном формалине, заключали в парафин и делали срезы толщиной 7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином.
Результаты и обсуждения
Клиническая картина заживления роговицы кроликов. На 10-е сутки после проведения операции были получены следующие результаты. При применении биорегулятора, выделенного из сыворотки крови (1-я группа), отмечали значительный стромальный отек роговицы, зрачок сужен, в конъюнктиве выражена перикорнеальная
инъекция сосудов, конъюнктива гиперемирована. Место эрозии окрашивалось диффузно флюоресцеином материковой формы 3,55 мм. Наблюдали увеальную реакцию, влага передней камеры отечная, очаги корнеомаляций, начало эпителизации. При воздействии биорегулятора, выделенного из роговицы глаза быка (2-я группа), наблюдали существенно меньшие признаки воспаления: конъюнктива была бледно-розовой, роговица в области раны прозрачная, блестящая, без выраженного отека, в области трепанационной раны было незначительное помутнение в виде флера, астигматизм не выражен. Окрашивание роговицы точечное, эпителизация почти полная, с участками патологической эпителизации до 0,5 мм. При исследовании действия композиции биорегуляторов (3-я группа) отмечали значительный стромальный отек роговицы, уходящий за пределы раны; конъюнктива была бледно-розовой, роговица прозрачная, наблюдали незначительное помутнение в виде облака, поверхностную васкуляризацию роговицы. Эпителизация роговицы неполная (множественные, не связанные флюоресцеином области окрашивания до 11,5 мм). Действие биорегуляторов, выделенных из роговицы глаза и сыворотки крови быка (4-я группа), при их последовательной инстилляции выражалось в умеренном диффузном стромальном отеке роговицы; конъюнктива была бледнорозовой. Наблюдали рубец средней интенсивности, точечное окрашивание флюоресцеином. При воздействии препаратом «БаларпанН» (5-я группа) наблюдали перикорнеальную инъекцию сосудов в конъюнктиве, локальный отек роговицы в области трепанационной раны, в центре раны выраженный рубец, роговица прозрачная, поверхностно окрашивалась флюоресцеином в области периметра дефекта. Все глаза, в которые инстиллировали физиологический раствор (контрольная группа), имели бледно-розовую конъюнктиву с чуть прозрачной роговицей, отек которой был выражен. В некоторых случаях в центре раны наблюдали сильно выраженный рубец, стромальный отек во внутренней части раны, перикорнеальную инъекцию сосудов, поверхностную васкуляризацию роговицы, участки корнеомаляции (гнойное разрушение роговицы) до 1 мм, окрашивание роговицы флюоресцеином было значительным (5-6 мм), наблюдали небольшое количество патологичного эпителия.
Результаты оценки слезопродукции (тест Ширмера), которые получили до проведения операции и на 10-е сутки эксперимента, практически не различались (5,5±2,0 мм/мин) и соответствовали норме. Не было отмечено влияния исследуемых препаратов на внутриглазное давление: показания составили 10±2,3 мм рт. ст. и соответствовали норме.
Данные гистологического исследования
При инстилляции физиологическим раствором (контрольная группа) в роговице можно отметить отслойку эпителия, местами — его полное отсутствие (вследствие деградации), воспаление в строме под эпителием. В некоторых случаях наблюдали значительные количества клеток воспаления в строме. При применении биорегулятора, выделенного из сыворотки крови (1-я группа), произошло небольшое утолщение роговицы, наблюдали хорошо выраженный многослойный эпителий, кое-где в области раны наблюдали отслойку эпителия, много клеток воспаления в строме, происходила васкуляризация. При воздействии биорегулятора, выделенного из роговицы глаза быка (2-я группа), наблюдали восстановление эпителиального слоя, незначительное воспаление под эпителием в области раны, адгезия между эпителием и стромой была нарушена
При действии композиции биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и роговицы глаза (3-я группа), происходила деградация и отслойка эпителия в области раны, в строме наблюдали воспаление, васкуляризацию. Обращает внимание значительное нарушение адгезионных взаимодействий между клетками и слоями роговицы. Исследование действия биорегуляторов, выделенных из роговицы глаза и сыворотки крови быка (4-я группа), при их последовательной инстилляции показало, что сохранялся нормальный многоклеточный эпителий, небольшое воспаление наблюдали лишь в строме в области раны, а также присутствовала незначительная отслойка эпителия в некоторых местах. Отмечалось значительное восстановление структуры ткани в области травмы, которое выражалось не только в образовании всех слоев роговицы, но и в установлении адгезионных взаимодействий между ними. При воздействии препаратом «БаларпанН» (5-я группа) наблюдали отслойку эпителия, воспаление в строме в области повреждения. Адгезионные взаимодействия между клетками и слоями роговицы не восстановлены полностью. Полученные в этом исследовании результаты свидетельствуют о способности биорегуляторов, выделенных из тканей глаза и сыворотки крови быка, стимулировать ранозаживление роговицы у кроликов in vivo. Однако ранозаживляющее действие биорегуляторов явно различается.
Во 2-й группе наблюдали небольшое воспаление стромы, эпителий был хорошо развит, несмотря на нарушение его адгезии со стромой. Полученные данные согласуются с результатами исследования этого регулятора на модели органотипического культивирования роговицы позвоночных животных in vitro, в которых было продемонстрировано протективное действие биорегулятора на состояние ткани, выражающееся в основном во влиянии на миграцию и пролиферацию эпителиальных клеток, а также на состояние стромы, предотвращая ее гидратацию и соответствующее набухание. В 1-й группе можно отметить развитие значительного воспаления в строме, хорошее состояние эпителия и его взаимодействие со стромой — отсутствие отслойки. Очевидно, что данный биорегулятор проявляет свойства фактора адгезии.
Эти результаты согласуются с данными ранее проведенных исследований, в которых отмечалась способность этого биорегулятора влиять на адгезионные взаимодействия клеток, особенно эндотелия роговицы. Оба биорегулятора более эффективно стимулируют ранозаживление роговицы, чем препарат «БаралпанН». Обращают на себя внимание принципиально разные результаты, полученные при совместном применении этих двух биорегуляторов. Композиция биорегуляторов в виде их общего раствора не оказывала ранозаживляющего действия — состояние роговицы у кроликов этой группы соответствовало состоянию ткани у животных контрольной серии.
В то же время при раздельной последовательной инстилляции эти же биорегуляторы оказали наиболее выраженное действие на заживление раны. Такое различие в биологическом действии растворов двух биорегуляторов, каждый из которых по отдельности стимулировал заживление раны в роговице, можно объяснить изменением наноразмерного состояния биорегуляторов в растворе, которое наступало в результате их взаимодействия. Ранее показано, что активность биорегуляторов данной группы определяется их наноразмерным состоянием в растворе. Можно предположить, что при сливании растворов двух биорегуляторов произошло образование наночастиц с новыми свойствами. При последовательной инстилляции растворов двух биорегуляторов их действие дополняло друг друга: биорегулятор, выделенный из роговицы, оказывал влияние на эпителиальные клетки, а биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, — на эндотелий и клеточные элементы стромы, а также на адгезию между отдельными слоями роговицы. Очевидно, это можно объяснить наличием тканевой специфичности действия биорегуляторов данной группы. Полученные результаты имеют большое значение при разработке фармакологических препаратов, основанных на биорегуляторах данной группы, в частности выделенных из роговицы глаза и сыворотки крови быка. Биорегуляторы, выделенные из тканей глаза и сыворотки крови быка, продемонстрировали способность влиять на ранозаживление роговицы у кроликов in vivo. Наиболее эффективное воздействие оказывало применение двух препаратов — выделенных из роговицы глаза и из сыворотки крови при их последовательной инстилляции. Это подтверждают данные клинического обследования, проведенного на 10-е сутки (флюоресцеиновый тест), и гистологического исследования роговиц глаз кроликов на 21-е сутки после нанесения травмы. В этом случае в области экспериментальной раны наблюдали восстановление структуры роговицы.
М.С. Краснов, В.П. Ямскова, А.А. Константиновский, Е.Ю. Рыбакова, И.А. Ямсков, Ю.А. Капитонов, М.К. Мусостова
НИИ глазных болезней имени Гельмгольца МЗ РФ
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова, г. Москва
Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова, г. Москва
Мусостова Малика Камалдиновна — аспирант отдела травм органа зрения, пластической и реконструктивной хирургии и глазного протезирования
Литература:
1. Гундорова Р.А., Хорошилова-Маслова И.П., Ченцова Е.В. и др. Применение адгелона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // Вопросы офтальмол. — 1997. — Т. 113, № 2. — С. 12-15.
2. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. и др. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных // Радиационная биология и радиоэкология. — 2003. — № 3. — С. 265-268.
3. Margasyuk D.V., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V. et al. Regulatory Protein from Bovine Cornea: Localization and Biological Activity // Biochemical physics frontal research. — 2007. — P. 47-59.
4. Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямсков И.А. и др. исследование регуляторного белка выделенного из роговицы быка // Изв. РАН: Сер. Биол. — 2008. — № 6. — С. 736-745.
5. Романова И.Ю., Гундорова Р.А., Ченцова Е.В. и др. Восстановительные процессы в роговице глаза после эрозийного поврежедниея и влияния них адгелона // Бюл. экспер. биол. — 2004. — Т. 138, № 11. — С. 505-507.
6. Ямскова В.П., Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Ямсков И.А. Влияние адгезии на состояние ткани роговицы при культивировании in vitro // Изв. РАН: Сер. биол. — 2009.—№1. —С.11-17.
7. Wolburg H., Willbold E., Layer P.G. Muller glia endfeet, a basal lamina and the polarity of retinal layers from properly in vitro only in the presence of marginal pigmentedepithelium // Cell Tissue Res. — 1991. — V. 264. — Р. 437-451.
8. Yamskova V.P., Krasnov M.S., Rybakova E.Yu. et al. Analysis of regulatory proteins from bovine blood serum that display biological activity at ultra low doses: 1. Isolation, purification and physicochemical properties // Biochemical physics frontal research. — N.Y., 2007. — P. 71-78.
