Влияние кросслинкинга на заживление экспериментальных хирургических ранений роговицы

Представлены данные клинико-лабораторного экспериментального исследования влияния кросслинкинга на раневой процесс роговицы. Описана гистоморфологическая картина непроникающих ранений роговицы после воздействия процедуры кросслинкинга роговичного коллагена на рану роговицы в 1-е или 7-е сутки.

Cross-linking effect on experimental surgical corneal wounds healing

Results of clinical and laboratory experimental research of cross-linking effect on corneal traumatic process is described. Histological and morphological aspects of nonpenetrating corneal injuries after corneal collagen cross-linking exposure on corneal wound in 1st and 7th day after trauma are performed.

Метод роговичного кросслинкинга, разработанный G. Wollensak с соавт. [1] как способ лечения кератоконуса, в настоящее время занимает основное место среди нехирургических способов лечения кератэктазий различного генеза [2]. Механизм кросслинкинга основан на повышении продукции короткоживущих свободных радикалов кислорода под воздействием низкоинтенсивного ультрафиолетового света на строму роговицы в присутствии фоточувствительной субстанции (рибофлавина). В свою очередь высвободившиеся радикалы кислорода вызывают образование дополнительных поперечных связей между коллагеновыми фибриллами стромы роговицы, повышая ее прочность, ригидность и биомеханическую стабильность.

Влияние кросслинкинга на морфофункциональные изменения клеточного состава и коллагенового каркаса разносторонне [3]. В литературе есть работы, изучающие процессы эпителизации после кросслинкинга роговицы, а также динамику изменений качественного и количественного состава клеток роговицы [4]. Установлено, что в зоне УФ-облучения по причине цитотоксического действия и апоптоза роговица лишается своего клеточного состава по всей толще, вплоть до эндотелия (в зоне облучения). Показано, что репопуляция клеток происходит в течение 4-6 недель после кросслинкинга. Также показано, что под влиянием кросслинкинга происходит увеличение диаметра коллагеновых фибрилл, причем более выражено в передних слоях стромы [5]. Вместе с тем доказано, что после кросслинкинга роговицы лимбальные и конъюнктивальные клетки, находящиеся вне зоны облучения, не претерпевают никаких изменений [6].

В настоящее время показания к кросслинкингу существенно расширяются. Методику, в качестве паллиативной, применяют при буллезной кератопатии [7] и язвенных поражениях роговицы, в том числе инфекционного характера [8, 9]. Последнее обстоятельство связано с тем, что еще в 1960-х годах было показано, что ультрафиолет в сочетании с рибофлавином инактивирует РНК вируса табачной мозаики [10]. Позже, было доказано, что подобный феномен проявляется и на других вирусах, бактериях и паразитах [11]. В то же время, как и для большинства медицинских процедур, кросслинкингу свойственны осложнения — кератомаляция [12], кератопатия [13], повреждение эндотелия [14]. Изучение возможности расширения сферы применения кросслинкинга, представляющего собой эффективный нехирургический метод лечения патологий роговицы, является актуальным.

Целью работы является экспериментальное изучение влияния кросслинкинга на образование и реорганизацию рубца в различные сроки раневого процесса в строме роговицы.

Материал и методы. Объектом исследования явились 20 кроликов породы шиншилла возраста 3 мес., весом не более2 кг, серо-черной окраски.

Правые глаза кроликов были опытными, левые — контрольными. В первой (данной) серии экспериментальной работы, на всех 40 глазах 20 животных, в качестве модели механического повреждения роговицы и раневого процесса было выбрано центральное непроникающее (несквозное) ранение роговицы длиной5 мми глубиной 300 мкм, незамедлительно ушитое посередине одним X-образным швом (нить нейлон, 10-00) с погружением узла в рану. Стандартизация длины разреза осуществлялась микрохирургическим циркулем, а глубины — использованием алмазного ножа с микрометром.

В 10 случаях сразу после наложения шва на правых глазах кроликов была выполнена процедура кросслинкинга (группа Iod). В остальных 10 случаях кросслинкинг на правых глазах был проведен на 7 сутки после ранения и ушивания роговицы (группа IIod). Левые глаза животных, являясь контрольными, процедуре кросслинкинга не подвергались (группы Ios и IIos).

 Экспериментальное исследование проведено с соблюдением международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных [15].

Хирургическое вмешательство осуществлялось стерильным инструментарием в условиях стерильного операционного поля под общей анестезией, которую осуществляли путем внутримышечного введения раствора кетамина гидрохлорида из расчета 30 мг на1 кгвеса и раствора рометара из расчета 0,2 мл на1 кгвеса. Анестезию слизистой глазного яблока достигали инстилляцией 0,5% раствора Алкаина в ходе операции. В условиях стерильного операционного поля, после инстилляции офтаквикса в конъюнктивальную полость накладывался векорасширитель. В оптическом центре циркулем Кастровьехо на эпителии отмечались границы планируемого разреза диной5,0 мм. Алмазным ножом с микрометром, осуществлялся непроникающий в переднюю камеру линейный разрез глубиной 300 мкм строго в пределах разметки и перпендикулярно поверхности роговицы. После этого рану ушивали Х образным швом нейлоновой нитью 10-00, с погружением узла в рану. Хирургический этап завершали субконъюктивальной инъекцией 1,0 мг раствора дексаметазона и 10,0 мг раствора гентамицина. В конъюктивальную полость всех левых глаз (группы Ios и IIos) и 10 правых глаз (IIod) закладывали мазь флоксал.

Остальные 10 правых глаз кроликов (группа Iod) подвергались процедуре кросслинкинга аппаратом UV-X (IROC AG, Швейцария) с использованием стерильного раствора 0,1% рибофлавина с декстраном и изотоническим раствором в виде готового препарата «Декстралинк» (ГУ «Уфимский НИИ ГБ» АН РБ).

Процедуру кросслинкинга роговичного коллагена выполняли при следующих характеристиках: длина волны 370 нм, интенсивность освещения <5 мВт/см2. Зона облучения составляла6,0 мм. Экспозиция 25-30 минут. Инстилляции «Декстралинка» проводились каждые 2 минуты.

Аналогичной процедуре были подвергнуты 10 правых глаз остальных кроликов (группа IIod), но на 7-е сутки после ранения и ушивания роговицы.

В послеоперационном периоде осуществлялись двукратные ежедневные инстилляции в оба глаза животных растворов антисептиков и кортикостероидов вплоть до удаления швов и еще 3 дня. Швы удаляли на 14-е сутки после их наложения, в условиях стерильного операционного поля под местной инстилляционной анестезией.

Осмотры осуществляли в первые две недели ежедневно, далее один раз в неделю. Использовали методики бокового и фокального освещения, при необходимости биомикроскопию, в сочетании с фоторегистрацией в динамике (Canon IXUS 7,0). Спустя 6 месяцев после экспериментального ранения роговицы кролики были выведены из эксперимента под общей анестезией (аналогичной вышеописанной) путем воздушной тромбоэмболии.

Энуклеированные глаза животных фиксировали в холодном 2%-ном растворе глютаральдегида на фосфатном буфере (pH=7.2). Вырезанные фрагменты роговицы размерами 1,5 х 1,5 смиз зоны очага дофиксировали в течение 2 часов в 1%-ном растворе осмиевой кислоты (OsO₄). Далее образцы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, ацетоне и заключали в смолу (смесь эпон-аралдит — фирма SPIsupplier, USA). Полутонкие срезы (толщиной 1-1,5 мкм) готовили на ультратоме Nova (LKB, Швеция) окрашивали полихромным красителем (метиленовый синий+фуксин) и исследовали на «Фотомикроскопе III» (Opton, Германия). Фотрегистрацию на цифровую фотовидеокамеру и морфометрический анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения фирмы «Мекос».

Результаты: На препаратах группы Iod (6 мес. после ранения и КЛ) область сформировавшегося нежного стромального рубца на всем протяжении была покрыта слоем гиперплазированного переднего эпителием, отличающимся увеличенным количеством слоев клеток, нередко увеличенных в размерах. (рис.1а) Причем поверхностные клетки, включая десквамированные, вместо плоской формы имели кубическую форму. Клетки базального слоя наоборот имели более вытянутую форму с частыми фигурами митоза. (рис.16) Причем заместительная гиперплазия была направлена в основном в сторону дефекта стромы, заполняя его. Под эпителием, в поверхностной 1/3 стромы роговицы, наблюдали локальную активацию и пролиферацию кератоцитов с появлением молодых клеток с округлыми или овальными ядрами, которые постепенно восполняли объем «утерянной» стромы. На более поздних сроках в результате дифференцировки молодых кератоцитов фиброцеллюлярная ткань преобразуется в полноценную строму с нормальными оптическими свойствами. Более глубокие стромальные слои роговицы, десцеметова мембрана и задний эпителий сохраняли свое нормальное гистологическое строение. (рис. 1в)

Рисунок 1. Гистологический срез роговицы кролика из группы Iod с крослинкингом, выполненным сразу после ушивания раны

а — ОКРАШИВАНИЕ X250: углубление в месте раны, которое не полностью заполнено гиперплазированным эпителием; фасетка, в которой визуализируется переход от нормального эпителия к гиперплазированному эпителию; в поверхностном слое клетки имеют цилиндрическую форму, находятся в стадии десквамации; клетки базального слоя более вытянуты, наблюдается компенсаторное деление эпителия в условиях дефекта стромы;

б — под базальным слоем эпителия наблюдается поверхностная активация кератоцитов в прилежащей строме, которые по своей форме напоминают фибробласты, эндотелий не изменен. ОКРАШИВАНИЕ (метиленовый синий+фуксин) УВЕЛИЧЕНИЕX125;

в — строма состоит из фиброцеллюларной ткани, целлюларные компоненты преобладают над фибробластами; наблюдается пролиферация с целью восстановления дефекта стромы; десцеметова оболочка и эндотелий интактны. ОКРАШИВАНИЕ(метиленовый синий+фуксин) Х250

В контрольной группе Ios (6 мес. после ранения без КЛ) также происходила заместительная гиперплазия переднего эпителия. (рис. 2а)  При этом субэпителиальная область фиброцеллюлярной пролиферации отличалась большим объемом, пирамидальной формой и более высокой плотностью клеточных элементов. Как и в группе Iod, десцеметова оболочка и эндотелий оставались неизмененными. В отличие от группы Iod, рубцовая ткань формировалась более плотная и менее прозрачная, что требовало более длительный период ее трансформации в обычную стромальную ткань.

Рисунок 2. Гистологический срез роговицы кролика из группы Iod без крослинкинга

а — визуализируется гиперплазия переднего эпителия по заместительному типу; в строме имеется участок, идущий перпендикулярно эпителию, который имеет повышенную плотность кератобластов. ОКРАШИВАНИЕ (метиленовый синий+фуксин) Х300;

б — четко визуализируется рубцовая ткань в виде пирамиды, основание которой обращено к заднему эпителию.ОКРАШИВАНИЕ Х125 (метиленовый синий+фуксин)

В случае выполнения кросслинкинга на 7-е сутки после ранения в условиях восстановленного эпителиального слоя (гр. II od) влияние кросслинкинга становится менее выраженным, по сравнению с гр. Iod, однако, несмотря на наличие эпителиальной фасетки в месте ранения, морфологическая картина соответствовала активации кератогенеза.

В группах Ios и IIos никаких морфологических отличий не выявлено. При сравнении между собой экспериментальных групп Iod и IIod выявленные морфологические отличия характеризуются замедленной активацией кератогенеза в группе IIod. Основные отличия морфологических результатов представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Основные отличия гистологических результатов в группах Iod, IIod, и I-IIos

Обсуждение. У млекопитающих заживление ранений, как правило, происходит путем заполнения раневого канала фиброзной тканью. Такое восстановление, как правило, способствует сохранению органа, но не его функций. Кроме того, такой процесс часто приводит к чрезмерному рубцеванию и контрактуре [16], что в офтальмологии проявляется деформирующими рубцами, пролиферативной витреоретинопатией, тракционной отслойкой сетчатки и другой патологией. В роговице фиброзное восстановление представляет особую проблему [17], так как приводит к снижению зрения не только по причине формирования непрозрачной рубцовой ткани, но также из-за нарушения сферичности роговицы. В настоящее время в связи со значительным ростом «популярности» офтальмологических операций, минимизирующих рефракционные изменения роговицы (факоэмульсификация, ламеллярная хирургия, фемтолазерные технологии) поиск механизмов и путей восстановления поврежденной роговицы с минимизацией негативных последствий приобретает особое значение.

Возможность влияния на репаративные процессы с восстановлением целостности, прозрачности роговицы и образованием тонкого и нежного рубца путем использования кросслинкинга представляется нам актуальным и перспективным направлением в офтальмотравматологии. Возможность исключения формирования или минимизации интесивности хейза после ламеллярной кератопластики, снижение интенсивности помутнения рубцовой ткани и ее астигматизмогенности после приникающих ранений роговицы, а также поиск новых показаний к применению кросслинкинкга являются сферой наших интересов.

Механизмы восстановления ткани роговицы во многом такие же, как и в любом другом органе. Тем не менее роговица имеет уникальные анатомические, клеточно-молекулярные и функциональные особенности, которые обуславливают важные механистические и функциональные различия. Установлено, что помутнение роговицы после стромального повреждения связано с дезорганизацией фиброзной ткани [18-20] и с отложением экстрацеллюлярного матрикса, что является причиной формирования хейза роговицы [21]. Однако последние исследования указывают на то, что хейз в большей степени обусловлен рассеянием света от фибробластов и миофибробластов зоны повреждения/восстановления [23].

Еще одним свидетельством в поддержку клеточных механизмов возникновения хейза является флюктуация хейза наблюдающаяся у пациентов на протяжении долгого времени, что не может быть объяснено простыми фибротическими механизмами. Таким образом, кросслинкинг оказывая влияние как на клеточный так и на внеклеточный состав стромы может влиять на интенсивность и (не)формирование хейза.

Ультрафиолетовое облучение роговицы, приводит к гибели кератоцитов, в том числе без использования фотосенсибилизирующего агента (рибофлавин) [24]. В то же время клиническое значение массивной потери кератоцитов не совсем понятно потому, что их потеря может легко компенсироваться миграцией из соседних участков. Есть сообщения, что потеря кератоцитов после LASIK [25] и ФРК провоцируют хейз [26]. Однако ни наш клинический опыт (неопубликованные данные) ни литературные данные не указывают на потерю прозрачности роговицы после кросслинкинга, что также подтверждают другие авторы [27, 28].

Заключение. Полученные нами морфологические результаты в данной серии эксперимента свидетельствуют о влиянии кросслинкинга на раневой процесс. В указанные сроки использованной экспериментальной модели это влияние осуществляется в зоне воздействия на весь клеточный и внеклеточный состав роговицы за исключением десцеметовой мембраны эндотелия. Эксперимент показал, что влияние кросслинкинга характеризуется:

1. Клетки базального слоя имеют более вытянутую форму с частыми фигурами митоза.

2. В строме роговицы (примерно в верхней его 1/3) наблюдалась локальная активация кератогенеза в виде появления молодых клеток с округлыми или овальными ядрами, которые постепенно восполняли объем «утерянной» стромы.

3. В результате дифференцировки молодых кератоцитов фиброцеллюлярная ткань преобразуется в полноценную строму с нормальными оптическими свойствами (в сроки наблюдения 6 мес.)

Таким образом, с целью определения клинических перспектив дальнейшее изучение влияния кросслинкинга на раневой процесс в различные сроки, в том числе с использованием других экспериментальных моделей оправдано.

В.В. Нероев, А.Б. Петухова, Р.А. Гундорова, О.Г. Оганесян

Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца МЗ РФ

Петухова Анастасия Борисовна — аспирант отдела травм органа зрения и глазного протезирования

Литература:

1. Wollensak G., Spoerl E., Seiler T. Riboflavin/ultraviolet–a–induced collagen crosslinking for the treatment of keratoconus // Am. J. Ophthalmol. — 2003. — V. 135, N 5. — P. 620-627.

2. Snibson G.R. Collagen crosslinking: a new treatment paradigm in corneal disease —a review // Clin Exp Ophthalmol. — 2010. — V. 38. — P. 141-153.

3. Greenstein Steven A., Fry Kristen L., Hersh Peter S. In Vivo Biomechanical Changes After Corneal Collagen Cross-linking for Keratoconus and Corneal Ectasia: 1-Year Analysis of a Randomized, Controlled, Clinical Trial // Cornea. — 2012. — V. 31, N 1. — P. 21-25.

4. Wollensa G., Iomdina E., Dittert D.D. Wound Healing in the Rabbit Cornea After Corneal Collagen Cross-Linking With Riboflavin and UVA // Cornea. — 2007. — V. 26, N 5. — P. 600-605.

5. Wollensak G., Wilsch M., Spoerl E. et al. Collagen Fiber Diameter in the Rabbit Cornea After Collagen Crosslinking by Riboflavin/UVA // Cornea. — 2004. — V. 23, N 5. — P. 503-507.

6. Wollensak G., Mazzotta C., Kalinski Th. Limbal and Conjunctival Epithelium After Corneal Cross-linking Using Riboflavin and UVA // Cornea. — 2011. — V. 30, N. 12. — P. 1448-1454.

7. Kozobolis V., Labiris G., Gkika M. UV-A Collagen Cross-Linking Treatment of Bullous Keratopathy Combined With Corneal Ulcer // Cornea. — 2010. — V. 29, N 2. — P. 235-238.

8. Makdoumi K., Mortensen J.C. Infectious Keratitis Treated With Corneal Crosslinking // Cornea. — 2010. — V. 29. N 12. — P. 1353-1358.

9. Galperin Gustavo, Berra Martín, Tau Julia. Treatment of Fungal Keratitis From Fusarium Infection by Corneal Cross-Linking // Cornea. — 2012. — V. 31, N 2. — P. 176-180.

10. Tsugita A., Okada Y., Uehara K. Photosensitized inactivation of ribonucleic acids in the presence of riboflavin.// Biochim Biophys Acta. — 1965. — V. 103. — P. 360-363.

11. Corbin F. Pathogen inactivation of blood components: current status and introduction of an approach using riboflavin as a photosensitizer // Int J Hematol. — 2002. — V. 76, Suppl 2. — P. 253-257.

12. Cardo L.J., Rentas F.J., Ketchum L. et al. Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light // Vox Sang. — 2006. — V. 90. — P. 85-91.

13. Gokhale Nikhil S., Vemuganti Geeta K. Diclofenac-induced Acute Corneal Melt After Collagen Crosslinking for Keratoconus // Cornea. — 2010. — V. 29, N 1. — P. 117-119.

14. Rodríguez-Ausín P., Gutiérrez-Ortega R., Arance-Gi Á. et al. Keratopathy After Cross-linking for Keratoconus // Cornea. — 2011. — V. 30. N 9. — P. 1051-1053.

15. Gokhale Nikhil S. Corneal Endothelial Damage After Collagen Cross-Linking Treatment // Cornea. — 2011. — V. 30. N12. — P. 1495-1498.

16. Гоглова О.О., Богомолов А.Ф. Этика работы с экспериментальными животными // Медицинское право и этика. — 2003. — C. 4.

17. Desmouliere A., Gabbiani G. The role of the myofibroblast in wound healing and fibrocontractive diseases. In: Clark RAF, ed. The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair. — New York: Plenum Press. — 1996. — P. 391-423.

18. Fini M.E. Keratocyte and fibroblast phenotypes in the repairing cornea // Prog Retin Eye Res. — 1999. — V. 18. — P. 529-551.

19. Cintron C., Schneider H., Kublin C. Corneal scar formation. // Exp Eye Res. — 1973. — V. 17. — P. 251-259.

20. Хорошилова-Маслова И.П. Травматическое поражение глаз: многотомное рук-во по патологической анатомии. — М.: Медгиз, 1963. — Т. 1. — С. 575-589.

21. Левкоева Э.Ф. К вопросу о роли избыточной регенерации в

заживлении ран глаза // Офтальмол. журн. — 1951. — № 4.— С. 186-190.

22. Grosvenor T. How predictable are the results of excimer laser photorefractive keratectomy? A review // Optom Vis Sci. — 1995. — V. 72. — P. 698-712.

23. Moller-Pedersen T., Li H.F., Petroll W.M. et al. Confocal microscopic characterization of wound repair after photorefractive keratectomy // Invest Ophthalmol Vis Sci. — 1998. — V. 39. — P. 487-501.

24. Jester J.V., Petroll W.M., Cavanagh H.D. Corneal stromal wound healing in refractive surgery: the role of myofibroblasts // Prog Retin Eye Res. —1999. — V. 18. — P. 311-356.

25. Moller-Pedersen T. Keratocyte reflectivity and corneal haze // Exp Eye Res. — 2004. — V. 78. — P. 553-560.

26. Wollensak G., Spoerl E., Wilsch M. Keratocyte Apoptosis After Corneal Collagen Cross-linking Using Riboflavin/UVA Treatment // Cornea. — 2004 — V. 23. Issue 1. — P. 43-49.

27. Wilson S.E. Keratocyte apoptosis in refractive surgery // CLAO J. — 1998. — V. 24. — P. 181-185.

28. Mitooka K., Ramirez M., Maguire L.J. et al. Keratocyte density of central human cornea after laser in situ keratomileusis //Am. J. Ophthalmol. — 2002. — V. 133. — P. 307-314.