Возможности использования глютатион S-трансферазы Р1-1 как дифференциального маркера новообразований щитовидной железы


УДК 616.441-006-07

Ранняя диагностика рака щитовидной железы (РЩЖ) остается в настоящее время актуальной проблемой современной тиреидологии. Поиск информативных маркеров РЩЖ является перспективным направлением дооперационного определения тактики лечения. Одним из таких маркеров может быть глютатион S-трансфераза Р1-1 (GSTP), вовлеченная в канцерогенез. В данной работе впервые показано, что в тканях ЩЖ человека регистрируется заметная активность GSTP, которая зависит от вида узлового образования. В большинстве случаев (до 70%) у больных с диагнозом «нетоксический зоб» наблюдалась многократное увеличение (1,5-8 раз) активности GSTP и экспрессии гена в опухолевой ткани по сравнению с нормальной. У 80% онкологических больных отмечалась противоположная тенденция: активность фермента и экспрессия гена в опухоли в 1,5-3 раза ниже, чем в прилегающей неопухолевой ткани. Такое перераспределение активности GSTP и экспрессии ее гена в доброкачественных и злокачественных тканях ЩЖ может служить основой для дальнейшей разработки метода дифференциальной диагностики этих новообразований.

Opportunities of use glutation S-transferase P1-1 as a differential marker thyroid neoplasms 

Early diagnostics of a thyroid cancer (TC) now remains an important problem of a modern thyroidology. Search of an informative markers of TC is the promising tool for the surgical treatment. Glutathione S-transferase P1-1 (GSTP) involved in carcinogenesis can be one of such markers. In this work for the first time we have shown that in thyroid tissues remarkable activity of GSTP depended on a type of tissue was registered. In most cases (to 70%) at patients with the diagnosis not toxic goiter it was observed repeated increase (1,5-8 times) activity of GSTP and gene expression in a tumoral tissues in comparison with the normal one. At 80% of patients with TC the opposite tendency was revealed: activity of enzyme and a gene expression in a tumor was in 1,5-3 times lower, than in an adjacent not tumor tissue. Such redistribution of activity of GSTP and expression of its gene in benign and malignant tissue can be an important mean for the further development of a diagnostic method of TC. 

Рак щитовидной железы (РЩЖ) занимает лидирующие позиции в структуре онкологических патологий органов эндокринной системы [1, 2]. Выявление рака щитовидной железы на ранних стадиях и дифференциальная диагностика доброкачественных новообразований являются на сегодня основной проблемой современной тиреидологии [3]. В настоящее время для своевременной диагностики и эффективного лечения злокачественных новообразований щитовидной железы активно ведется поиск новых молекулярных маркеров с использованием геномных и протеиномных подходов [4, 5]. Так, показано, что соматические мутации в протоонкогене RET, регистрируемые в 25-33% случаев спорадической медуллярной карциномы, связаны с неблагоприятным прогнозом для этого типа рака [6, 7]. Установлено также, что рецепторы тирозин киназ, также могут быть вовлечены в патогенез рака щитовидной железы, а мутации в онкогене BRAF — наиболее частые генетические изменения в папиллярной тиреоидной карциноме [8, 9]. Такие исследования открывают широкие перспективы для применения таргетной терапии в лечении рака щитовидной железы [10]. Поэтому актуальным является поиск новых информативных маркеров для дифференциальной диагностики различных типов опухолей щитовидной железы. Известно, что одним из патогенетических механизмов злокачественной трансформации тканей щитовидной железы является нарушение баланса тиреоидных гормонов [11]. Регуляция такого баланса осуществляется ферментативными системами детоксификации ксенобиотиков. Глутатион S-трансфераза класса Р (GSTP), осуществляющая метаболизм как экзогенных, так и эндогенных субстратов, является одним из таких ферментов [12]. В настоящее время этот фермент рассматривается как важная мишень в диагностике и терапии злокачественных опухолей различной локализации [13-15]. Однако до сих пор не определена роль, которую играет GSTP1-1 в развитии рака щитовидной железы.

Целью настоящей работы является исследование возможности применения GSTP1-1 в качестве онкомаркера при дифференцированном раке щитовидной железы на основании измерения ее ферментативной активности и экспрессии гена в узловых новообразованиях и нормальных тканях щитовидной железы человека.


Материалы и методы

Клинический материал

В работе проанализировано 49 образцов новообразований щитовидной железы человека, удаленных в ходе хирургического вмешательства. В качестве контроля использовали визуально неизмененную гистологически подтвержденную тиреоидную ткань. Исследуемые образцы были распределены по следующим группам: 22 образца папиллярного рака I-II стадии (возраст — 25-69 лет) и 27 образцов диффузно-узлового нетоксического зоба (возраст — 31-64 года).

Исследования соответствовали этическим стандартам биоэтического комитета ГУ НИИ МББ СО РАМН, разработанным в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Все лица, участвующие в исследовании, дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.


Определение уровня экспрессии гена GSTP1-1

Выделение суммарной РНК из тканей ЩЖ проводили гуанидин-фенольным методом. Уровень экспрессии определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР.

Для проведения ОТ-ПЦР использовались праймеры, синтезированные в компании «Лаборатория Медиген», Новосибирск (табл. 1).

Таблица 1.

Праймеры для генов GSTP1-1, GAPDH и β-актина человека 

Ген

Последовательности нуклеотидных праймеров

Температура отжига (˚C)

Размер продуктов ПЦР (п.о).

β-актин

Прямой

5′-acc cac act gtg ccc atc ta — 3′

59

298

Обратный

5′ — cgg aac cgc tca ttg cc — 3′

59

GAPDH

Прямой

5′-GGGCGCCTGGTCACCA — 3′

62

350

Обратный

5′-AACATGGGGGCATCAGCAGA — 3′

62

GSTP1-1

Прямой

5’-CATGCTGCTGGCAGATCA-3’

63

233

Обратный

3’-CATTCACCATGTCCACCAG-3’

63

 

Для количественной оценки уровня экспрессии электрофореграмма была денситометрирована, результаты были представлены как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена GSТР1-1 к интенсивности полосы гена домашнего хозяйства GAPDH (у.е.). Типичная картина разделения продуктов амплификации генов GSТР1-1и GAPDH представлена на рис. 1.

Рисунок 1. Картина разделения продуктов амплификации генов GSТР1-1и GAPDH. 1— больной с диагнозом «рак ЩЖ»; 2, 3 — больные с диагнозом «ДУЗ ЩЖ»; Н — нетрансформированная ткань, О — опухолевая ткань

1 

Измерение ферментативной активности GSTР1-1

Ферментативная активность GSTР была измерена в цитозольной фракции замороженных тканей щитовидной железы (ЩЖ) с использованием этакриновой кислоты (ЕА) как субстрата. Реакция проводилась в калий-фосфатном буфере (0,1М КН2РО4, рН 6,5). К 300 мкМ раствору ЕА добавлялся глютатион GSH (конечная концентрация 5мМ). В случае ферментативной реакции раствор также содержал 10-70 мкг белка. Через 4 мин. к реакционной смеси добавляли двукратный объем хлористого метилена. Смесь тщательно перемешивали в течение 30 сек., после чего центрифугировали и отбирали водную фазу. В раствор вводился внутренний стандарт кортизол (6 мкг/ мл). Анализ метаболитов проводился методом ВЭЖХ (рис. 2).

 Рисунок 2. Хроматограмма разделения продуктов реакции. 

2

1 — EA-SG, 2 — внутренний стандарт 

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью программ STATISTICA и Origin 7.0. Для оценки достоверности различий между выборками использовался t-критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение 

Ферменты II фазы метаболизма ксенобиотиков участвуют в метаболизме многих ксенобиотиков и эндогенных соединений. Фермент GSTP1-1 играет ключевую роль в инактивации гормонов, в том числе и тиреоидных [12]. В связи с этим, нами была измерена активность GSTP1-1 в узловых новообразованиях щитовидной железы: в 10 послеоперационных образцах диффузно-узлового зоба (ДУЗ) и 9 образцах папиллярного рака щитовидной железы (ПРЩЖ) (рис. 3).

Рисунок 3. Активность GSТР1-1 в узловых новообразованиях щитовидной железы. Повышение в 1,5-3,4 раза при ДУЗ. Понижение в 1,5 раза при ПРЩЖ

3 

Результаты показали 1,5–3,4-кратное повышение ферментативной активности (с 5,1 нмоль/мин/мг до 7,5-17 нмоль/мин/мг) у 70% больных ДУЗ. С другой стороны, активность этого фермента была снижена в 1,5 раза в злокачественных тканях у 80% больных ПРЩЖ.

Для подтверждения полученных данных были проведены эксперименты по определению уровня экспрессии гена GSTP в щитовидной железе с использованием метода полуколичественной мультиплексной ОТ-ПЦР. Экспрессия была измерена в образцах опухолевых и нормальных тканей у 30 больных (17 больных ДУЗ и 13 — ПРЩЖ). Для оценки уровня экспрессии электрофореграмма была денситометрирована, результаты были представлены как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы гена GSTP к интенсивности полосы гена GAPDH. Полученные результаты показали, что также у 70% больных с диагнозом «ДУЗ» (12 пациентов из 17) наблюдалось повышение уровня экспрессии гена GSTP в узловых образованиях по сравнению с нормой (от 1,35 до 8 раз), у 3 больных он не менялся, а у 2 понижался (в 1,5 и 2,5 раза).

В случае рака щитовидной железы у 77% больных наблюдается понижение уровня экспрессии гена GSTP в опухолевой ткани ЩЖ в 1,5-3 раза (10 пациентов из 13). У трех остальных больных экспрессия GSTP существенно не изменялась.

Рисунок 4. Экспрессия гена GSТР1-1 в узловых новообразованиях щитовидной железы. Повышение в 1,4-8 раз при ДУЗ. Понижение в 1,5-3 раза при ПРЩЖ

4 

Известно, что фермент GSTP1-1 участвует в процессах детоксификации чужеродных соединений и способен вызывать эффекты множественной лекарственной устойчивости [12, 16]. Он также играет немаловажную роль в ответе организма на окислительный стресс. Однако наибольшее внимание этот фермент вызывает в связи с его участием в процессах канцерогенеза. На сегодня показана роль этого фермента во многих видах рака, где он рассматривается как возможный опухолевый маркер (гепатоцеллюлярный рак, рак простаты, молочной железы и др.) [13-15]. Эксперименты с опухолевыми патологиями щитовидной железы выполнены впервые. Полученные результаты выявили различный профиль экспрессии GSTP в тканях щитовидной железы. Так, у больных с диагнозом «ДУЗ» выявлено повышение ферментативной активности GSTP1-1 в узловых образованиях ЩЖ. При ПРЩЖ наблюдалась обратная тенденция — снижение активности в опухолевых тканях по сравнению с нормой. Для того чтобы выявить, на каком молекулярном уровне происходит изменение ферментативной активности GSTP1-1, был измерен уровень мРНК ее гена. Полученные результаты отражают ту же тенденцию, что и данные по ферментативной активности: повышение уровня мРНК GSTP в опухолевой ткани по сравнению с нормой при ДУЗ и понижение при ПРЩЖ. Таким образом, можно судить о том, что изменение ферментативной активности GSTP1-1 при заболеваниях ЩЖ происходит на транскрипционном уровне. Тогда можно говорить о том, что в процессы трансформации тканей щитовидной железы вовлечены механизмы, регулирующие экспрессию гена GSTP1-1. Однако сложно ответить на вопрос, является ли изменение в экспрессии гена причиной или следствием канцерогенеза ЩЖ.

Заключение

В работе первые показано, что в тканях ЩЖ регистрируется изменение активности фермента GSTP1-1. В большинстве случаев у больных с диагнозом «нетоксический зоб» наблюдается существенное увеличение активности GSTP в измененной ткани по сравнению с нормальной. У больных ПРЩЖ отмечена противоположная тенденция: активность фермента в опухоли ниже, чем в норме. Эти результаты были подтвержденными данными по экспрессии ее гена методом ОТ-ПЦР. Последний является высокоспецифичным и чувствительным методом, который может быть рекомендован в виде дифференциально-диагностического приема при тонкоигольной аспирационной пункционной биопсии узлов щитовидной железы.

 

С.П. Шевченко, С.В. Сидоров, Л.А. Мостович, Л.Ф. Гуляева

Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск

Городская клиническая больница № 1 , г. Новосибирск

Новосибирский национальный исследовательский государственный университет 

Шевченко Сергей Петрович — кандидат медицинских наук, доцент кафедры хирургических болезней медицинского факультета НГУ, заведующий отделением опухолей голова-шея и хирургической онкоэндокринологией

 

 

Литература:

1. Берштейн Л.М. Рак щитовидной железы: эпидемиология, эндокринология, факторы и механизмы канцерогенеза // Практ. онкол. — 2007. — № 8. — С. 1-8.

2. Agate L., Lorusso L., Elisei R. New and old knowledge on differentiated thyroid cancer epidemiology and risk factors // J. Endocrinol. Invest. — 2012. — Vol. 35. — Р. 3-9.

3. Grubbs E.G., Rich T.A., Li G. et al. Recent advances in thyroid cancer // Curr. Probl. Surg. — 2008. — Vol. 45. — Р. 156-250.

4. Carpi A., Mechanick J.I., Saussez S., Nicolini A. Thyroid tumor marker genomics and proteomics: diagnostic and clinical implications // J. Cel.l Physiol. — 2010. — Vol. 224. — Р. 612-619.

5. Gilfillan C.P. Review of the genetics of thyroid tumours: diagnostic and prognostic implications // ANZ J. Surg. — 2010. — Vol. 80. — Р. 33-40.

6. Elisei R., Cosci B., Romei C. et al. Prognostic significance of somatic RET oncogene mutations in sporadic medullary thyroid cancer: a 10-year follow-up study // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2008. — Vol. 93. — Р. 682-687.

7. Figlioli G., Landi S., Romei C., Elisei R., Gemignani F. Medullary thyroid carcinoma (MTC) and RET proto-oncogene: Mutation spectrum in the familial cases and a meta-analysis of studies on the sporadic form // Mutat Res. — 2012; pii: S1383-5742(12)00062-2. doi: 10.1016/j.mrrev.2012.09.002.

8. Lam A.K., Lau K.K., Gopalan V. et al. Quantitative analysis of the expression of TGF-alpha and EGFR in papillary thyroid carcinoma: clinicopathological relevance // Pathology. — 2011. — Vol. 43, № 1. — Р. 40-47.

9. Xing M. BRAF mutation in papillary thyroid cancer: pathogenic role, molecular bases, and clinical implications // Endocr. Rev. — 2007. — Vol. 28. — Р. 742-762.

10. Sherman S.I. Targeted therapy of thyroid cancer // Biochem. Pharmacol. — 2010. — Vol. 80. — Р. 592-601.

11. Cheng S.Y., Leonard J.L., Davis P.J. Molecular aspects of thyroid hormone actions //

Endocr. Rev. — 2010. — Vol. 31. — Р. 139-170.

12. Vasieva O. The many faces of glutathione transferase pi // Curr. Mol. Med. — 2011. — Vol. 11, № 2. — Р. 129-139.

13. Jain S., Chen S., Chang K.C., Lin Y.J. et al. Impact of the location of CpG methylation within the GSTP1 gene on its specificity as a DNA marker for hepatocellular carcinoma // PLoS One. — 2012. — Vol. 7, № 4: e35789.

14. Yoon H.Y., Kim S.K., Kim Y.W. et al. Combined hypermethylation of APC and GSTP1 as a molecular marker for prostate cancer: quantitative pyrosequencing analysis // J. Biomol. Screen. — 2012. — Vol. 17, № 7. — Р. 987-992.

15. Franco R.L., Schenka N.G., Schenka A.A. et al. Glutathione S-transferase Pi expression in invasive breast cancer and its relation with the clinical outcome // J. BUON. — 2012. — Vol. 17, № 2. — Р. 259-264.

16. Tew K.D., Manevich Y., Grek C. et al. The role of glutathione S-transferase P in signaling pathways and S-glutathionylation in cancer // Free Radic Biol Med. — 2011. — Vol. 51, № 2. — Р. 299-313.